Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

25Evolução Molecular e Filogenômica

Em 1968 Motoo Kimura fez uma conta que abalou um campo. Comparando as hemoglobinas, os citocromos e outras proteínas de mamíferos cujos ancestrais comuns estavam datados por fósseis, ele descobriu que os aminoácidos tinham sido substituídos a uma taxa de cerca de uma substituição por sítio por bilhão de anos — o que, num genoma de mamífero e numa geração, dava uma nova substituição fixada na população a cada dois anos mais ou menos. Haldane havia mostrado, uma década antes, que a seleção natural consegue fixar no máximo cerca de uma substituição a cada trezentas gerações antes que o custo em prole perdida se torne impagável. A aritmética deixava uma só saída: a maior parte das mudanças que se acumulam no DNA não é movida por seleção alguma, mas é neutra, fixada por acaso em populações finitas, a uma taxa que — como mostra o primeiro teorema deste capítulo — é simplesmente a taxa de mutação. A teoria neutra virou a hipótese nula da evolução molecular, a linha de base contra a qual a seleção é detectada; o relógio molecular virou um modo de datar o que os fósseis não datavam; e os genomas sequenciados desde então deram as ferramentas para ver, gene a gene, onde a seleção agiu, como genes novos nascem de velhos e por que a árvore de um gene nem sempre é a árvore de sua espécie.

25.1 Deriva, mutação e a taxa neutra

Teorema 25.1 (A taxa neutra de substituição)

Numa população diploide de $N$ indivíduos, uma mutação nova sem efeito sobre a aptidão tem probabilidade $1/2N$ de acabar substituindo todos os outros alelos (fixação) e $1 - 1/2N$ de ser perdida. Se cada uma das $2N$ cópias gênicas muta à taxa $\mu$ por geração, surgem $2N\mu$ mutações neutras novas por geração e, no longo prazo, a taxa em que as substituições se acumulam é

k = 2N\mu\times\frac{1}{2N} = \mu :

a taxa de substituição neutra é igual à taxa de mutação, independentemente do tamanho da população. Uma mutação destinada a se fixar leva em média $4N$ gerações para tanto, de modo que populações grandes guardam mais variação em trânsito, mas não a fixam mais depressa. Para uma mutação com vantagem seletiva $s$ , a fórmula de Kimura dá a probabilidade de fixação

P(s) = \frac{1 - \mathrm{e}^{-2s}}{1 - \mathrm{e}^{-4Ns}} \approx 2s \quad (4Ns \gg 1),

de modo que uma vantagem de $1\,\%$ se fixa com probabilidade de cerca de $2\,\%$ — quarenta vezes a chance de uma mutação neutra numa população de dois mil, mas ainda assim perdida quarenta e nove vezes em cinquenta; e uma desvantagem $s < 0$ com $4N|s| \gg 1$ praticamente nunca se fixa, enquanto uma com $4N|s| \ll 1$ se comporta como neutra: a seleção só vê o que a deriva não engole, e a fronteira é $|s| \sim 1/4N$ — efetivamente neutra.

Demonstração. Neutralidade: alguma cópia presente hoje será a ancestral de toda a população num futuro distante e, por simetria, cada uma das $2N$ cópias tem igual chance de ser ela; a mutante nova é uma cópia, daí $1/2N$ . Taxa: substituições por geração $=$ (mutações surgidas por geração) $\times$ (probabilidade de cada uma se fixar) $= 2N\mu/2N$ . A fórmula de Kimura decorre da aproximação por difusão da variação da frequência alélica sob deriva e seleção, aqui admitida; seus limites se verificam diretamente: quando $s \to 0$ , $(2s)/(4Ns) = 1/2N$ , o valor neutro; para $4Ns \gg 1$ o denominador é $1$ e o numerador, $\approx 2s$ . Tempo de fixação: a frequência de um alelo neutro faz um passeio aleatório com variância $p(1-p)/2N$ por geração, e o tempo esperado para chegar a $1$ a partir de $1/2N$ , condicionado a isso acontecer, é de $4N$ gerações (Kimura e Ohta, 1969), admitido. ∎

A probabilidade de fixação de Kimura em função do coeficiente de seleção escalonado, para N = 1000. Perto de zero a curva passa pelo valor neutro; à direita ela sobe rumo a 2s; à esquerda ela despenca. A seleção só age sobre o que a deriva não consegue esconder. — A probabilidade de fixação de Kimura em função do coeficiente de seleção escalonado, para $N = 1000$ . Perto de zero a curva passa pelo valor neutro; à direita ela sobe rumo a $2s$ ; à esquerda ela despenca. A seleção só age sobre o que a deriva não consegue esconder.

Evidência. Kimura (1968) e King e Jukes (1969) fizeram o argumento a partir das taxas: a taxa observada de substituição de aminoácidos nas proteínas dos mamíferos implicava mais substituições por geração do que o custo da seleção de Haldane permitia, de modo que a maioria tinha de ser neutra. As previsões da teoria então se confirmaram: as taxas são mais altas onde a função é menos restrita — sítios sinônimos, íntrons, pseudogenes, a terceira posição do códon — e mais baixas nas histonas e na ubiquitina, que mudam um resíduo a cada cem milhões de anos; o nível de variação dentro das espécies acompanha a mutação e o tamanho populacional; e a taxa de substituição por ano é aproximadamente constante entre linhagens com tamanhos populacionais muito diferentes, como a fórmula $k = \mu$ exige e uma explicação selecionista não. A controvérsia que se seguiu não a derrubou: ela fixou a taxa neutra como a hipótese nula contra a qual se mede a seleção. ∎

À esquerda: Motoo Kimura (1924–1994), que mostrou que a maior parte da mudança molecular é fixada por acaso e na taxa de mutação (fotografia, 1986, CC BY 4.0). À direita: um peixe-gelo antártico, cujo sangue é impedido de congelar por uma glicoproteína anticongelante montada, uns dez milhões de anos atrás, a partir de um gene duplicado de enzima digestiva e de uma sequência de repetições.

25.2 O relógio molecular

Proposição 25.2 (O relógio e suas irregularidades)

Se as substituições se acumulam a uma taxa constante $k$ por sítio por ano em duas linhagens que se separaram há $T$ anos, a fração de sítios em que elas diferem é, para valores pequenos, $d \approx 2kT$ : a divergência de duas sequências é um relógio molecular (Zuckerkandl e Pauling, 1965), que pode ser calibrado por uma separação datada por fóssil e então lido para separações sem fósseis. O relógio é estocástico — um processo de Poisson, de modo que $d$ tem variância aproximadamente igual à sua média para um número fixo de sítios — e é irregular de três modos conhecidos. Cada proteína tem sua própria taxa, fixada pela fração de seus sítios que a função permite mudar: os fibrinopeptídeos a $8$ , a hemoglobina a $1$ , o citocromo $c$ a $0.3$ e a histona H4 a $0.01$ substituição por sítio por bilhão de anos. As taxas diferem entre linhagens: como a taxa neutra é $\mu$ por geração, os animais de gerações curtas (roedores) acumulam mais mudança por ano que os de gerações longas (primatas, baleias) — o efeito do tempo de geração, em parte compensado porque as taxas de mutação por geração sobem com a duração da geração. E $d$ satura: uma vez que muitos sítios já mudaram, mudanças adicionais atingem sítios já mudados, de modo que a diferença bruta precisa ser corrigida para múltiplos acertos, como fazem as distâncias do capítulo de alinhamento. Os relógios relaxados modernos deixam a taxa variar entre ramos dentro de um modelo estatístico e são calibrados por muitos fósseis ao mesmo tempo; eles datam a separação entre humanos e chimpanzés em seis a sete milhões de anos, a das ordens de mamíferos placentários perto do fim do Cretáceo e a dos animais e fungos no Pré-Cambriano, com incertezas de dez a vinte por cento que vêm sobretudo dos fósseis.

Demonstração. Cada linhagem acumula $kT$ substituições por sítio, de modo que a diferença entre elas é $2kT$ onde os sítios não foram atingidos duas vezes; um par datado por fóssil dá $k = d/2T$ . A variância de Poisson e as taxas por proteína são as de Zuckerkandl e Pauling, as de Dickerson (1971) e os ajustes de Kimura a conjuntos de proteínas de vertebrados; a correção de saturação é a fórmula de Jukes–Cantor do capítulo de alinhamento, $d_{\text{real}} = -\tfrac{3}{4}\ln(1 - \tfrac{4}{3}p)$ . A variação de taxa entre linhagens foi mostrada por testes de taxa relativa: com um grupo externo $O$ e duas espécies $A$ e $B$ , as distâncias $d_{AO} - d_{BO}$ deveriam ser zero sob um relógio estrito, e não são para roedores contra primatas. ∎

O relógio molecular, proteína por proteína. Cada uma corre a sua própria taxa, fixada por quanto da molécula a função deixa livre para mudar: um fibrinopeptídeo, cortado e descartado quando o sangue coagula, muda centenas de vezes mais depressa que a histona que empacota o DNA.

25.3 Ler a seleção nas sequências

Definição 25.3 (dN/dS)

Num gene codificador de proteína, uma substituição é sinônima se deixa o aminoácido inalterado e não sinônima se o muda. Como o código genético deixa a maioria das terceiras posições e algumas primeiras posições mudarem em silêncio, cerca de um quarto das mutações possíveis num gene típico é sinônimo. Seja $d_{S}$ o número de substituições sinônimas por sítio sinônimo e $d_{N}$ o de substituições não sinônimas por sítio não sinônimo, cada um corrigido para múltiplos acertos. As mudanças sinônimas são quase neutras, de modo que $d_{S}$ estima $2\mu T$ — o relógio; e a razão

\omega = \frac{d_{N}}{d_{S}}

mede o que a seleção fez com a proteína: $\omega = 1$ se as mudanças de aminoácido são tão livres quanto as silenciosas (sem restrição, como num pseudogene); $\omega < 1$ sob seleção purificadora, com a maioria das mudanças removida — o gene típico tem $\omega \approx 0.1$ a $0.2$ , e as histonas, $0.001$ ; $\omega > 1$ sob seleção positiva, com as mudanças de aminoácido favorecidas mais depressa do que a deriva sozinha permitiria — a fenda de ligação ao antígeno das moléculas de MHC, as proteínas de superfície dos vírus numa corrida armamentista com os anticorpos, as proteínas do espermatozoide e do óvulo na fecundação, e a lisozima dos ruminantes, recrutada para digerir bactérias no estômago. Calculado ao longo de um ramo de uma árvore ou sítio a sítio, $\omega$ mapeia onde e quando uma proteína foi mudada pela seleção, e não pelo acaso.

Ordens de grandeza de . Quase todo gene fica bem abaixo de um, com seus aminoácidos guardados pela seleção purificadora; um pseudogene deriva em um; os poucos acima de um são as proteínas em corridas armamentistas ou recém-recrutadas para um trabalho. — Ordens de grandeza de $\omega$ . Quase todo gene fica bem abaixo de um, com seus aminoácidos guardados pela seleção purificadora; um pseudogene deriva em um; os poucos acima de um são as proteínas em corridas armamentistas ou recém-recrutadas para um trabalho.

Método 25.4 (Estimar $d_{N}/d_{S}$ )

(1) Alinhe as duas sequências codificadoras códon a códon (alinhe as proteínas e depois mapeie de volta ao DNA, para que nenhuma lacuna quebre a fase de leitura). (2) Para cada códon conte os sítios sinônimos e não sinônimos: cada uma de suas três posições é pontuada pela fração de mudanças possíveis que são silenciosas — uma terceira posição de degenerescência quádrupla conta como um sítio sinônimo, uma posição em que toda mudança altera o aminoácido conta como um sítio não sinônimo, e uma posição dupla como um terço de um e dois terços do outro. Some sobre os códons: $S$ sítios sinônimos e $N$ não sinônimos, com $S + N = 3 \times$ códons. (3) Conte as diferenças sinônimas e não sinônimas entre as sequências, resolvendo os códons que diferem em duas posições pela média sobre os caminhos possíveis. (4) $p_{S} =$ diferenças $/S$ , $p_{N} =$ diferenças $/N$ ; corrija cada um para múltiplos acertos com Jukes–Cantor. (5) $\omega = d_{N}/d_{S}$ ; teste $\omega \ne 1$ contra a variância amostral, que é grande quando $d_{S}$ é pequeno — duas sequências muito aparentadas dão uma razão pouco confiável, e duas muito distantes têm um $d_{S}$ saturado. (6) Para onde e quando: ajuste $\omega$ por ramo de uma árvore, ou por sítio com uma mistura de classes de sítios, e teste se uma classe com $\omega > 1$ melhora o ajuste.

25.4 Genes novos a partir de velhos

Definição 25.5 (Duplicação, famílias e transferência)

A maioria dos genes novos é cópia de genes velhos. Uma duplicação gênica — por permuta desigual, retrotransposição ou a duplicação de um genoma inteiro, como ocorreu duas vezes na origem dos vertebrados e de novo no ancestral dos peixes teleósteos e em muitas linhagens de plantas — deixa dois parálogos onde havia um; genes de espécies diferentes descendentes de um único gene ancestral são ortólogos. O destino usual da cópia é o decaimento: livre da restrição ( $\omega \to 1$ ) ela acumula um códon de parada ou uma mudança de fase e vira um pseudogene, dos quais o genoma humano carrega uns vinte mil. Às vezes as duas sobrevivem: por neofuncionalização, com uma cópia adquirindo uma função nova enquanto a outra mantém a velha (a glicoproteína anticongelante do peixe-gelo, a partir de um gene de tripsinogênio; as opsinas vermelha e verde dos primatas, a partir de uma duplicação de quarenta milhões de anos atrás que deu a visão tricromática descrita no volume do Ano 1; as cristalinas do cristalino, a partir de enzimas metabólicas); ou por subfuncionalização, com cada cópia mantendo parte da expressão ou da atividade do ancestral, de modo que as duas se tornam necessárias. A duplicação repetida constrói famílias gênicas — as globinas, os agrupamentos Hox do capítulo do desenvolvimento, os mil genes de receptores olfatórios de um camundongo, um terço deles pseudogenes nos humanos. A outra fonte de genes novos é a transferência horizontal: as bactérias adquirem genes de bactérias não aparentadas por plasmídeos, fagos e DNA livre, que é como a resistência a antibióticos cruza espécies num hospital e por que a “espécie” de uma bactéria é um genoma central cercado por uma nuvem móvel; nos eucariotos a transferência é mais rara, mas real — o T-DNA que a Agrobacterium insere nas plantas, os genes bacterianos dos rotíferos bdeloides, e as antigas transferências em massa que foram a mitocôndria e o cloroplasto. Onde a transferência é comum, a história da vida é uma rede, e a árvore desenhada a partir de um único gene é a árvore daquele gene.

Os destinos de um gene duplicado. Livre da restrição, a cópia extra em geral decai; ocasionalmente ela é capturada pela seleção para uma função nova, ou as duas cópias dividem entre si a função antiga.

Evidência. Ohno (1970) propôs a duplicação como principal fonte de genes novos antes que uma única família tivesse sido sequenciada; as globinas o confirmaram, com sua árvore de $\alpha$ , $\beta$ , $\gamma$ , $\delta$ , mioglobina e as globinas de plantas e bactérias casando datas de duplicação com a radiação dos vertebrados. Chen, DeVries e Cheng (1997) mostraram que o gene anticongelante do peixe-gelo compartilha sua sequência-sinal e suas sequências flanqueadoras com o tripsinogênio e que as repetições anticongelantes surgiram pela expansão de um pedaço de nove nucleotídeos que atravessa uma junção éxon–íntron: uma proteína nova feita com as peças avulsas de uma enzima digestiva, datada pelo relógio no congelamento do Oceano Austral. Thornton e colaboradores (2006) reconstruíram a sequência ancestral dos receptores de esteroides, sintetizaram a proteína de 450 milhões de anos e verificaram que ela só respondia a estrógenos; duas substituições posteriores, identificadas e testadas, mudaram a preferência da cópia duplicada para o cortisol — um ancestral ressuscitado e o caminho entre ele e seus descendentes percorrido no laboratório. ∎

25.5 Árvores gênicas e árvores de espécies

Proposição 25.6 (Separação incompleta de linhagens)

A árvore de um gene não precisa coincidir com a árvore das espécies que o carregam. Considere três espécies com árvore de espécies $((A,B),C)$ , com a separação $A$ – $B$ precedida por uma população ancestral de tamanho $N$ que persistiu por $T$ gerações antes da separação de $C$ . Duas cópias gênicas, uma de $A$ e outra de $B$ , rastreadas para trás, coalescem num ancestral comum a uma taxa $1/2N$ por geração; a probabilidade de que ainda não tenham coalescido quando entram na população ancestral das três é $\mathrm{e}^{-T/2N}$ , e então as três linhagens coalescem em ordem aleatória, de modo que em dois terços das vezes a árvore gênica agrupa $A$ ou $B$ com $C$ . A probabilidade de a árvore gênica discordar da árvore de espécies é, portanto,

P_{\text{discord}} = \tfrac{2}{3}\,\mathrm{e}^{-T/2N} .

Para humanos, chimpanzés e gorilas, com $T$ de algumas centenas de milhares de gerações e $N$ perto de $50\,000$ , cerca de um terço do genoma sustenta uma árvore em que os humanos estão mais próximos dos gorilas, ou os chimpanzés dos gorilas, do que diz a árvore de espécies — o que se observa. Essa separação incompleta de linhagens, junto com a duplicação e perda e a transferência horizontal, é a razão pela qual a filogenômica infere a árvore de espécies a partir de milhares de árvores gênicas sob um modelo do coalescente, em vez de concatená-las e desenhar uma só; ela também permite estimar os próprios tamanhos populacionais ancestrais a partir da fração de árvores discordantes, e ler hibridações antigas (DNA neandertal nos humanos modernos, o fluxo gênico entre ursos, entre borboletas) em árvores que discordam numa direção que a deriva sozinha não produziria.

Demonstração. Duas linhagens numa população diploide de $N$ escolhem pais entre $2N$ cópias a cada geração e compartilham um com probabilidade $1/2N$ ; ao longo de $T$ gerações a chance de nunca o fazerem é $(1 - 1/2N)^{T} \approx \mathrm{e}^{-T/2N}$ . Três linhagens que entram na população ancestral comum são permutáveis, de modo que o primeiro par a coalescer é cada um dos três pares com probabilidade $1/3$ ; só o par $(A,B)$ corresponde à árvore de espécies, e daí $2/3$ desses casos serem discordantes. Nem a taxa do coalescente nem a permutabilidade dependem do gene, de modo que a fórmula vale para cada locus neutro independentemente, e a fração de árvores discordantes ao longo de um genoma estima $\mathrm{e}^{-T/2N}$ . ∎

Árvores gênicas dentro de uma árvore de espécies. Os tubos cinzentos são populações; as linhas são a ancestralidade de um gene. As linhagens que não se encontram na curta população ancestral entram juntas na mais profunda e se emparelham ao acaso — de modo que um terço do genoma de três espécies próximas conta uma história diferente da das próprias espécies.

Exemplo 25.7 (Ler a história de um genoma)

As quinhentas espécies de ciclídeos do Lago Vitória surgiram nos quinze mil anos desde que o lago voltou a encher — depressa demais para a mutação fornecer as diferenças entre elas. Seus genomas mostram como: as variantes que distinguem um que se alimenta no fundo de um que raspa algas já estavam presentes como variação permanente nos peixes de rio que colonizaram o lago, foram separadas e recombinadas, e ainda aumentadas pela hibridação entre linhagens; os genes de opsina foram sintonizados para água clara ou turva por substituições que o $\omega$ de seus ramos mostra terem sido selecionadas; e as árvores gênicas discordam umas das outras ao longo do genoma exatamente no padrão que a separação incompleta de linhagens e o fluxo gênico preveem. Uma radiação não é a origem de genes novos, mas a redistribuição de alelos antigos em combinações novas sob nova seleção — o que as sequências registram, alelo a alelo, para quem souber ler uma árvore que é, na verdade, uma floresta.

Ciclídeos de um lago africano: centenas de espécies em poucos milhares de anos, com suas diferenças tiradas em boa parte da variação que seus ancestrais comuns já carregavam.

Observação 25.8 (O acaso como linha de base)

A teoria neutra não é a afirmação de que a seleção é pouco importante; é uma afirmação do que acontece quando a seleção está ausente, precisa o bastante para ser testada. Como a taxa neutra é a taxa de mutação, a divergência mede tempo; como a mudança neutra preenche os sítios que a seleção deixa livres, $\omega$ mede restrição; como as linhagens neutras coalescem a uma taxa conhecida, a discordância das árvores gênicas mede o tamanho de populações que ninguém viu. A seleção é, então, o que resta depois de subtraído o acaso — um gene com $\omega$ acima de um, uma varredura que esvaziou a variação de uma região, uma árvore que discorda numa direção que a deriva não explica. O anticongelante do peixe-gelo antártico, a lisozima estomacal do ruminante e a terceira opsina do primata são as exceções encontradas assim, e cada uma é a história de um gene copiado e de um trabalho novo. O resto do genoma é um relógio.

25.6 Exercícios

Exercício 25.1 ★

Enuncie a taxa neutra de substituição e explique em palavras por que ela não depende do tamanho da população.

Solução

Solução de Exercício 25.1.

$k = \mu$ : a taxa neutra de substituição por sítio por geração é igual à taxa de mutação. A cada geração surgem $2N\mu$ mutações neutras novas e cada uma tem probabilidade $1/2N$ de se fixar; uma população maior faz mais mutações e dá a cada uma uma chance proporcionalmente menor, e os dois efeitos se cancelam exatamente.

Exercício 25.2 ★

Defina ortólogo, parálogo e pseudogene, com um exemplo de cada um na família das globinas.

Solução

Solução de Exercício 25.2.

Ortólogos: genes de duas espécies descendentes de um gene do ancestral comum — a $\beta$ -globina humana e a $\beta$ -globina de camundongo. Parálogos: genes de um mesmo genoma descendentes de uma duplicação — a $\alpha$ - e a $\beta$ -globina humanas, ou a $\beta$ e a $\gamma$ . Pseudogene: uma cópia decaída que já não codifica proteína — o gene $\psi\beta$ do agrupamento da $\beta$ -globina humana, completo com códons de parada.

Exercício 25.3 ★

O que $\omega = d_{N}/d_{S}$ mede? Interprete $\omega = 0.02$ , $\omega = 1.0$ e $\omega = 2.5$ , e nomeie um gene de cada tipo.

Solução

Solução de Exercício 25.3.

$\omega$ compara a taxa de substituição que muda aminoácidos com a taxa de substituição silenciosa, que é a linha de base neutra. $0.02$ : seleção purificadora forte, com $98\,\%$ das mudanças de aminoácido removidas — actina, histona H3. $1.0$ : nenhuma restrição — um pseudogene. $2.5$ : seleção positiva, com as mudanças de aminoácido favorecidas — a fenda de ligação a peptídeos do MHC, o envelope do HIV, a lisozima de ruminante.

Exercício 25.4 ★

Por que Kimura concluiu que a maioria das substituições é neutra? Reenuncie o argumento com os números da abertura do capítulo.

Solução

Solução de Exercício 25.4.

As proteínas comparadas entre mamíferos mudam a cerca de uma substituição por sítio por bilhão de anos; num genoma de um bilhão de sítios codificadores e numa geração de alguns anos, isso é da ordem de uma substituição fixada por geração, ou uma a cada dois anos. O custo da seleção de Haldane permite cerca de uma substituição selecionada a cada trezentas gerações. As taxas diferem por um fator de cem ou mais, de modo que quase todas as mudanças fixadas precisam ser neutras.

Exercício 25.5 ★★

$N = 5000$ . Calcule a probabilidade de fixação de uma mutação nova com $s = 0$ , $s = 0.001$ , $s = 0.01$ e $s = -0.001$ , usando a fórmula de Kimura, e comente quais são efetivamente neutras.

Solução

Solução de Exercício 25.5.

Neutra: $1/2N = 10^{-4}$ . $s = 0.001$ , $4Ns = 20$ : $(1 - \mathrm{e}^{-0.002})/ (1 - \mathrm{e}^{-20}) = 0.002$ . $s = 0.01$ : $0.0198$ . $s = -0.001$ : $(1 - \mathrm{e}^{0.002})/(1 - \mathrm{e}^{20}) = 0.002\,\mathrm{e}^{-20} = 4\times 10^{-12}$ . Nenhuma é efetivamente neutra: isso exigiria $|4Ns| \lesssim 1$ , isto é, $|s| \lesssim 5\times 10^{-5}$ ; um coeficiente de seleção de um décimo de por cento já é decisivo numa população de cinco mil.

Exercício 25.6 ★★

Duas espécies diferem em $12\,\%$ dos sítios de um gene cuja taxa neutra é de $2 \times 10^{-9}\,$ por sítio por ano. Estime o tempo de divergência com e sem a correção de Jukes–Cantor. Em que diferença bruta a correção chega a um fator de dois?

Solução

Solução de Exercício 25.6.

Sem correção: $T = 0.12/(2\times 2\times 10^{-9}) = 30\,\mathrm{Myr}$ . Jukes–Cantor: $d = -\tfrac{3}{4}\ln(1 - 0.16) = 0.131$ , $T = 33\,\mathrm{Myr}$ . A correção chega a um fator de dois quando $-\tfrac{3}{4} \ln(1 - 4p/3) = 2p$ , em $p \approx 0.6$ : a essa altura a diferença bruta já perdeu a maior parte de sua informação.

Exercício 25.7 ★★

Um gene de 300 códons tem 700 sítios não sinônimos e 200 sinônimos. Entre duas espécies ele mostra 7 diferenças não sinônimas e 10 sinônimas. Calcule $p_{N}$ , $p_{S}$ e $\omega$ (sem correção). Que regime de seleção? E se as contagens fossem 35 e 10?

Solução

Solução de Exercício 25.7.

$p_{N} = 7/700 = 0.010$ , $p_{S} = 10/200 = 0.050$ , $\omega = 0.2$ : seleção purificadora removendo quatro quintos das mudanças de aminoácido. Com $35$ e $10$ : $p_{N} = 0.05$ , $\omega = 1$ : nenhuma restrição detectável — um pseudogene, ou um gene em que a seleção positiva em alguns sítios equilibra a purificadora em outros.

Exercício 25.8 ★★

As sequências neutras de humano e chimpanzé diferem em $1.2\,\%$ ; a separação foi há $6.5\,\mathrm{Myr}$ , com tempo de geração de $25\,\mathrm{yr}$ . Estime a taxa de mutação por sítio por geração e o número de mutações novas num genoma diploide de $6\times 10^{9}$ bases a cada geração.

Solução

Solução de Exercício 25.8.

$k = d/2T = 0.012/(1.3\times 10^{7}) = 9.2\times 10^{-10}$ por sítio por ano; $\mu = 25k = 2.3\times 10^{-8}$ por sítio por geração; $6\times 10^{9}\times 2.3\times 10^{-8} \approx 140$ mutações novas por genoma diploide por geração. O sequenciamento direto de pais e filhos encontra cerca de setenta: a estimativa a partir da divergência é inflada pelo polimorfismo já presente na população ancestral, que acrescenta algumas centenas de milhares de gerações à separação aparente.

Exercício 25.9 ★★

Com $N = 50\,000$ e $T = 100\,000$ gerações entre as duas separações, calcule a fração de árvores gênicas discordantes da árvore de espécies para humano, chimpanzé e gorila. Que $T$ a tornaria de $10\,\%$ ?

Solução

Solução de Exercício 25.9.

$\mathrm{e}^{-T/2N} = \mathrm{e}^{-1} = 0.37$ ; fração discordante $\tfrac{2}{3} \times 0.37 = 0.25$ . Para $10\,\%$ : $\mathrm{e}^{-T/2N} = 0.15$ , $T = 2N\ln(1/0.15) = 190\,000$ gerações.

Exercício 25.10 ★★★

Mostre que a fórmula de Kimura se reduz a $1/2N$ quando $s \to 0$ e a $2s$ para $4Ns \gg 1$ , e que para $s < 0$ com $4N|s| \gg 1$ ela se comporta como $2|s|\,\mathrm{e}^{-4N|s|}$ . Daí estime quão fortemente deletéria uma mutação precisa ser, numa população de $10^{4}$ , para ter sua probabilidade de fixação reduzida cem vezes abaixo da neutra.

Solução

Solução de Exercício 25.10.

Quando $s \to 0$ : $1 - \mathrm{e}^{-2s} \approx 2s$ e $1 - \mathrm{e}^{-4Ns} \approx 4Ns$ , razão $1/2N$ . Para $4Ns \gg 1$ o denominador é $1$ e o numerador, $\approx 2s$ . Para $s < 0$ com $4N|s| \gg 1$ : numerador $1 - \mathrm{e}^{2|s|} \approx -2|s|$ , denominador $1 - \mathrm{e}^{4N|s|} \approx -\mathrm{e}^{4N|s|}$ , de modo que $P \approx 2|s|\,\mathrm{e}^{-4N|s|}$ . Cem vezes abaixo da neutra em $N = 10^{4}$ : $2|s|\,\mathrm{e}^{-4\times 10^{4}|s|} = 5\times 10^{-7}$ ; $|s| = 1.6\times 10^{-4}$ dá $3.2\times 10^{-4}\times \mathrm{e}^{-6.4} = 5.3\times 10^{-7}$ . Logo $|s| \approx 1.6\times 10^{-4}$ , $4N|s| \approx 6.5$ : uma desvantagem de um centésimo de por cento basta, em dez mil indivíduos, para tornar a fixação cem vezes mais rara que o acaso.

Exercício 25.11 ★★★

Um teste de taxa relativa: um grupo externo $O$ está a uma distância corrigida de $0.30$ do camundongo e de $0.24$ do humano, e camundongo e humano estão a $0.20$ um do outro. Calcule os comprimentos dos ramos do camundongo e do humano desde sua separação (suponha que o ponto de separação é equidistante de $O$ pelos dois caminhos) e sua razão. Com uma geração de camundongo de $0.5\,\mathrm{yr}$ e uma humana de $25\,\mathrm{yr}$ , o que um relógio estrito por geração preveria para a razão, e o que a observação diz sobre as taxas de mutação por geração?

Solução

Solução de Exercício 25.11.

Com o ponto de separação a uma distância $a$ de $O$ pelos dois caminhos, $a + m = 0.30$ , $a + h = 0.24$ , $m + h = 0.20$ : $m - h = 0.06$ , de modo que $m = 0.13$ , $h = 0.07$ , razão $1.9$ . Um relógio estrito por geração daria a razão das contagens de gerações, $25/0.5 = 50$ . O $1.9$ observado significa que o camundongo acumulou apenas o dobro da mudança humana por ano, apesar de cinquenta vezes as gerações: a taxa de mutação por geração precisa ser umas $25$ vezes maior nos humanos — mais divisões celulares germinativas por geração —, de modo que, por ano, as duas linhagens difiram por um fator de apenas dois.

Exercício 25.12 ★★★

Um gene duplicado é liberado da restrição ( $\omega = 1$ ) a uma taxa neutra $k = 2 \times 10^{-9}\,$ por sítio por ano. Numa sequência codificadora de 1000 bases, quantos anos, aproximadamente, até se esperar o primeiro códon de parada ou mudança de fase (suponha que cerca de $4\,\%$ das mutações pontuais aleatórias numa sequência codificadora criam um códon de parada, e ignore as inserções e deleções)? Compare com o tempo que a seleção tem para encontrar uma função nova e explique por que a maioria das duplicatas morre.

Solução

Solução de Exercício 25.12.

As substituições que criam paradas chegam a $1000\times 2\times 10^{-9}\times 0.04 = 8\times 10^{-8}$ por ano: a primeira é esperada depois de cerca de $12\,\mathrm{Myr}$ (as mudanças de fase mais ou menos reduzem isso à metade). Nessa janela, uma mutação benéfica, uma em $10^{3}$ a $10^{5}$ de todas as mutações, tem muito menos chance de chegar que um códon de parada e, mesmo quando chega, só se fixa com probabilidade $2s$ . Assim, a cópia em geral já está morta antes que a seleção lhe encontre uso — a meia-vida observada das duplicatas em vertebrados é de alguns milhões de anos.

25.7 Problema: A Taxa da Mudança

Problema 25.1

Problema de fim de semana — a história de um genoma em números: a taxa de mutação a partir da divergência humano–chimpanzé, a carga de substituição de Kimura, as chances de fixação de mutações selecionadas, o $\omega$ de um gene a partir de contagens de códons, o relógio lido para uma duplicação e a discordância das árvores gênicas entre os grandes primatas, terminando na taxa de mutação, no $\omega$ do gene e na fração discordante

Dados: divergência neutra humano–chimpanzé $d = 0.012$ ; separação há $6.5\,\mathrm{Myr}$ ; geração de $25\,\mathrm{yr}$ ; genoma diploide de $6\times 10^{9}$ bases, $1.5\,\%$ codificador. População ancestral $N = 50\,000$ . Gene: 400 códons, 920 sítios não sinônimos e 280 sinônimos; diferenças humano–camundongo de 46 não sinônimas e 84 sinônimas. Separação humano–camundongo há $90\,\mathrm{Myr}$ . Globina: $\alpha$ e $\beta$ diferem em $55\,\%$ dos sítios de aminoácidos (bruto); taxa da hemoglobina de $1 \times 10^{-9}$ por sítio por ano. Primatas: $T$ entre as separações do gorila e do chimpanzé, $80\,000$ gerações. Limite de Haldane: uma substituição selecionada a cada 300 gerações.

Parte I — A taxa.

A partir de $d = 2kT$ , calcule $k$ por sítio por ano e depois $\mu$ por sítio por geração.
Mutações novas por genoma diploide por geração, e quantas delas caem em sequência codificadora.
Substituições fixadas por geração em todo o genoma na taxa neutra (a população fixa $\mu$ por sítio por geração). Compare com o limite de Haldane e tire a conclusão de Kimura.
Numa população de $N = 50\,000$ , quantas mutações neutras novas surgem por sítio por geração em toda a população, e que fração delas jamais se fixará?
Quanto tempo leva uma mutação neutra destinada a se fixar, em gerações e em anos? Compare com o tempo decorrido desde a separação humano–chimpanzé.
Explique por que, apesar da questão 5, a divergência entre duas espécies mede o tempo desde sua separação, e não o tempo desde a fixação de seus alelos.

Parte II — As chances da seleção.

Probabilidade de fixação de uma mutação neutra em $N = 50\,000$ , e de uma com $s = 0.001$ , $s = 0.01$ , $s = 0.1$ .
Para que $s$ vale $4Ns = 1$ ? Interprete a fronteira.
Uma mutação deletéria com $s = -0.001$ : probabilidade de fixação em relação à neutra. E com $s = -10^{-5}$ ?
Se uma fração $10^{-5}$ das mutações novas num gene é benéfica com $s = 0.01$ e o restante é neutro, que fração das substituições nesse gene é adaptativa? Comente quão raramente a seleção aparece na sequência, mesmo quando age.
Calcule $p_{N}$ e $p_{S}$ para o gene humano–camundongo, corrija cada um com Jukes–Cantor e dê $\omega$ .
Interprete $\omega$ ; e estime a taxa neutra que o $d_{S}$ do gene implica (por sítio por ano) usando o tempo de separação. Ela é consistente com a questão 1?

Parte III — Relógios e cópias.

Corrija a diferença entre as globinas $\alpha$ e $\beta$ para múltiplos acertos (use $d = -\ln(1 - p)$ , a versão proteica com muitos estados) e date a duplicação com a taxa da hemoglobina.
A data cai perto da origem dos vertebrados mandibulados ( $450\text{ a }500\,\mathrm{Myr}$ ). O que ter cadeias $\alpha$ e $\beta$ separadas permite que uma cadeia única não permite?
Os fibrinopeptídeos mudam a $8\times 10^{-9}$ por sítio por ano. Duas espécies se separaram há $40\,\mathrm{Myr}$ : diferença bruta esperada? Por que essa proteína é inútil para datar separações de $500\,\mathrm{Myr}$ ?
A histona H4 muda a $10^{-11}$ : quantas substituições em 100 sítios ao longo de $1000\,\mathrm{Myr}$ ? Por que ela é inútil para datar separações recentes?
Um gene duplicado deriva com $\omega = 1$ desde o momento da duplicação. Se $4\,\%$ das substituições em sequência codificadora criam paradas, e o gene tem 1200 sítios a uma taxa de $2\times 10^{-9}$ por sítio por ano, estime o tempo esperado até o primeiro códon de parada.
Por que a duplicação do genoma inteiro dá às duplicatas uma chance melhor de sobrevivência que uma única duplicação em tandem?

Parte IV — Árvores dentro de árvores.

Probabilidade de que uma linhagem humana e uma de chimpanzé não coalesçam nas $80\,000$ gerações anteriores à separação do gorila.
Fração de árvores gênicas discordantes da árvore de espécies. Observado: cerca de $30\,\%$ . É consistente?
Das árvores discordantes, que fração agrupa o humano com o gorila e que fração agrupa o chimpanzé com o gorila? O que um desvio forte da igualdade indicaria?
Se a população ancestral tivesse sido $N = 10\,000$ , que fração discordante você esperaria? O que a fração observada diz, portanto, sobre os números de nossos ancestrais?
Por que concatenar mil genes num único alinhamento dá uma árvore confiante, mas possivelmente errada, e o que um método do coalescente faz em vez disso?
O DNA neandertal nos humanos não africanos é de cerca de $2\,\%$ , e as árvores que o carregam agrupam alguns europeus com os neandertais mais vezes que os africanos. Por que isso não é separação incompleta de linhagens?
Resuma: $\mu$ (questão 1), o $\omega$ do gene (questão 11) e a fração discordante (questão 20).

Solução

Solução de Problema 25.1.

1. $k = 0.012/(2\times 6.5\times 10^{6}) = 9.2\times 10^{-10}$ por sítio por ano; $\mu = 25k = 2.3\times 10^{-8}$ por sítio por geração. 2. $6\times 10^{9}\times 2.3\times 10^{-8} \approx 140$ mutações novas por genoma diploide; $1.5\,\%$ delas, cerca de $2$ , em sequência codificadora. 3. Por genoma haploide, $3\times 10^{9}\times 2.3\times 10^{-8} \approx 70$ substituições fixadas por geração, contra o $1/300$ de Haldane: vinte mil vezes mais do que a seleção poderia impulsionar, de modo que a esmagadora maioria é neutra. 4. $2N\mu = 10^{5}\times 2.3\times 10^{-8} = 2.3\times 10^{-3}$ mutações novas por sítio por geração na população; $1/2N = 10^{-5}$ delas se fixarão. 5. $4N = 200\,000$ gerações, $5\,\mathrm{Myr}$ — quase tanto quanto o tempo decorrido desde a separação. 6. A divergência conta as mutações que surgiram ao longo das duas linhagens separadas desde seu ancestral comum; cada uma se fixa dentro de sua própria linhagem, e a taxa de longo prazo é $\mu$ qualquer que seja o tempo que cada uma leve, já que as mutações surgem de modo constante e a demora só atrasa o fluxo, sem alterá-lo. (A única correção é para o polimorfismo presente na separação, que torna o ancestral comum de dois alelos mais velho que a separação das espécies.) 7. Neutra, $10^{-5}$ ; $s = 0.001$ : $0.002$ ; $s = 0.01$ : $0.0198$ ; $s = 0.1$ : $1 - \mathrm{e}^{-0.2} = 0.18$ . 8. $s = 1/4N = 5\times 10^{-6}$ : abaixo disso a deriva engole a seleção e a mutação se comporta como neutra; acima disso a seleção governa as chances. 9. $s = -0.001$ : $P = 0.002\,\mathrm{e}^{-200}$ , zero para todos os efeitos — $10^{-85}$ da neutra. $s = -10^{-5}$ , $4N|s| = 2$ : $P = 2\times 10^{-5}/(\mathrm{e}^{2} - 1) = 3.1\times 10^{-6}$ , $31\,\%$ da neutra: as mutações levemente deletérias de fato se fixam. 10. Substituições benéficas por sítio por geração: $2N\times 10^{-5}\mu\times 2s = 10^{5}\times 10^{-5}\times 0.02\,\mu = 0.02\mu$ ; neutras: $\approx\mu$ . Fração adaptativa $0.02/1.02 \approx 2\,\%$ . Embora cada mutação benéfica tenha duas mil vezes mais chance de se fixar que uma neutra, elas são tão raras que apenas uma substituição em cinquenta é adaptativa: a seleção age e mal aparece. 11. $p_{N} = 46/920 = 0.050$ , $p_{S} = 84/280 = 0.30$ . Corrigidos: $d_{N} = -\tfrac{3}{4}\ln(1 - 0.0667) = 0.052$ , $d_{S} = -\tfrac{3}{4} \ln(1 - 0.40) = 0.38$ . $\omega = 0.14$ . 12. Seleção purificadora removendo cerca de $86\,\%$ das mudanças de aminoácido — um gene típico. $k = d_{S}/2T = 0.38/(1.8\times 10^{8}) = 2.1\times 10^{-9}$ por sítio por ano: o dobro do valor humano–chimpanzé, como se espera de uma comparação que inclui a linhagem de roedores, de relógio rápido; a mesma ordem de grandeza. 13. $d = -\ln(1 - 0.55) = 0.80$ por sítio; $T = 0.80/(2\times 10^{-9}) = 400\,\mathrm{Myr}$ . 14. Duas cadeias diferentes formam o tetrâmero $\alpha_{2}\beta_{2}$ , cuja ligação cooperativa ao oxigênio, efeito Bohr e controle alostérico pelo 2,3-bisfosfoglicerato dependem da interface entre subunidades diferentes; e o agrupamento $\beta$ pôde então se diversificar em cadeias embrionárias, fetais e adultas com afinidades diferentes. 15. $2kT = 2\times 8\times 10^{-9}\times 4\times 10^{7} = 0.64$ substituição por sítio; com a saturação entre vinte aminoácidos a diferença bruta é de cerca de $0.95(1 - \mathrm{e}^{-0.64/0.95}) \approx 0.47$ . Em $500\,\mathrm{Myr}$ , $d = 8$ : todo sítio já mudou muitas vezes e a diferença bruta fica em seu teto de $95\,\%$ , sem carregar informação alguma sobre o tempo. 16. $10^{-11}\times 10^{9}\times 100\times 2 = 2$ substituições entre duas linhagens em 100 sítios ao longo de um bilhão de anos. Para uma separação de $10\,\mathrm{Myr}$ a expectativa é $0.02$ : quase sempre nenhuma diferença, nenhuma resolução. 17. $1200\times 2\times 10^{-9}\times 0.04 = 9.6\times 10^{-8}$ por ano: a primeira parada é esperada depois de cerca de $10\,\mathrm{Myr}$ . 18. Duplicar o genoma inteiro duplica todo gene ao mesmo tempo, de modo que a estequiometria das proteínas que interagem é preservada e nenhum desequilíbrio de dosagem seleciona contra as cópias; uma duplicata isolada em tandem altera a dose de um gene e muitas vezes é deletéria, ou é imediatamente redundante e livre para decair. 19. $\mathrm{e}^{-80\,000/100\,000} = \mathrm{e}^{-0.8} = 0.45$ . 20. $\tfrac{2}{3}\times 0.45 = 0.30$ : consistente com os $30\,\%$ observados. 21. Metade cada, com $15\,\%$ de todas as árvores agrupando humano com gorila e $15\,\%$ chimpanzé com gorila. Um claro excesso de um deles indicaria fluxo gênico entre essas duas espécies após sua separação, o que a deriva não consegue produzir. 22. $N = 10\,000$ : $\mathrm{e}^{-4} = 0.018$ , discordância de $1.2\,\%$ . Os $30\,\%$ observados exigem, portanto, uma população ancestral de uns cinquenta mil — várias vezes o tamanho efetivo dos humanos de hoje. 23. A concatenação supõe que todo gene tem a árvore de espécies; com separação incompleta de linhagens os genes têm muitas árvores e, para ramos internos curtos, a árvore gênica mais comum pode diferir da árvore de espécies, de modo que mais dados tornam a resposta errada mais confiante. Um método do coalescente calcula, para cada árvore de espécies candidata, a distribuição esperada de árvores gênicas, e escolhe a árvore de espécies que melhor explica as frequências observadas. 24. A separação incompleta de linhagens aconteceu na população ancestral comum de todos os humanos modernos, de modo que tornaria toda população humana igualmente aparentada aos neandertais. Um excesso nos não africanos significa que os alelos neandertais entraram depois que os ancestrais dos não africanos deixaram a África: mistura, uns cinquenta mil anos atrás. 25. $\mu \approx 2.3\times 10^{-8}$ por sítio por geração; $\omega \approx 0.14$ ; cerca de $30\,\%$ das árvores gênicas discordantes da árvore de espécies.

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