Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

6Engenharia genética e biotecnologia

Até 1982 todo diabético do mundo era mantido vivo por insulina extraída do pâncreas de porcos e de bois — umas oito mil toneladas de glândulas para cada tonelada de hormônio, na mesma proporção — e uma fração dos pacientes reagia contra a proteína estranha. Naquele ano chegou ao mercado o primeiro fármaco feito por um organismo geneticamente modificado: a insulina humana, sintetizada por Escherichia coli que carregava o gene humano num plasmídeo. As ferramentas que tornaram isso possível haviam sido reunidas na década anterior — enzimas que cortam o DNA em sequências escolhidas, enzimas que unem os pedaços, plasmídeos que os levam para dentro de uma célula e os copiam ali — e a elas se juntaram, nas décadas seguintes, a reação em cadeia da polimerase, a injeção de genes em embriões e, desde 2012, um sistema imune bacteriano transformado numa tesoura programável capaz de reescrever uma letra de um genoma numa célula viva. Este capítulo trata dessas ferramentas, da aritmética que rege seu uso e do que já se construiu com elas, de um camundongo que brilha a uma cura para a doença falciforme.

6.1 Cortar, unir e copiar DNA

Definição 6.1 (Enzimas de restrição, ligase e vetores)

Uma enzima de restrição do tipo II é uma endonuclease bacteriana que corta o DNA de fita dupla numa sequência específica de $4\text{ a }8$ pares de bases, em geral um palíndromo: a EcoRI corta G $^{\downarrow}$ AATTC, deixando saliências de fita simples de quatro bases (extremidades coesivas) complementares a qualquer outra extremidade EcoRI; outras enzimas deixam extremidades cegas. A DNA-ligase sela dois fragmentos cujas extremidades se encaixam. Um vetor é uma molécula de DNA que se replica num hospedeiro e pode carregar um fragmento inserido: um plasmídeo de algumas quilobases com uma origem de replicação, um marcador de seleção (um gene de resistência a antibiótico, de modo que só as células que receberam o plasmídeo crescem no antibiótico) e um agrupamento de sítios de restrição únicos para o inserto; o bacteriófago $\lambda$ , cosmídeos e cromossomos artificiais de bactéria ou de levedura para insertos de $20\text{ a }1000\,\mathrm{kb}$ . O DNA entra numa bactéria por transformação, depois de um choque químico ou elétrico que torna a membrana transitoriamente permeável, com eficiência de $10^{6}$ a $10^{9}$ transformantes por micrograma de plasmídeo. Uma molécula recombinante é a que une DNA de duas fontes.

Evidência. Cohen, Chang, Boyer e Helling (1973) cortaram com EcoRI o plasmídeo pSC101 e um segundo plasmídeo que carregava outro gene de resistência, misturaram e ligaram os fragmentos, transformaram E. coli e recuperaram colônias resistentes aos dois antibióticos, que carregavam um único plasmídeo feito dos dois — o primeiro DNA recombinante a se replicar numa célula. No ano seguinte inseriram genes de RNA ribossômico de um sapo no pSC101 e mostraram que o DNA do anfíbio era replicado, e transcrito, na bactéria: os genes cruzam a fronteira entre os reinos sem mudar, e uma bactéria copia qualquer DNA que lhe deem. ∎

Um vetor de clonagem e sua química. O plasmídeo carrega uma origem, um marcador de seleção e um sítio de restrição único ao qual se liga um fragmento cortado pela mesma enzima; as extremidades coesivas tornam compatíveis dois fragmentos quaisquer cortados pela mesma enzima.

Método 6.2 (Clonar um gene)

(1) Obtenha o inserto: corte o DNA genômico com uma enzima de restrição, ou copie o RNA mensageiro em DNA complementar (cDNA, que não tem íntrons e por isso pode ser expresso em bactérias), ou amplifique o gene por PCR com iniciadores que carregam sítios de restrição. (2) Corte o vetor e o inserto com a(s) mesma(s) enzima(s) — duas enzimas diferentes forçam a orientação do inserto — e ligue-os. (3) Transforme bactérias e plaqueie no antibiótico: só as células com plasmídeo crescem. (4) Distinga os plasmídeos com inserto dos que se fecharam sobre si mesmos: um gene marcador interrompido pelo sítio de clonagem (lacZ: as colônias brancas têm inserto, as azuis não). (5) Faça a triagem das colônias em busca do inserto desejado: por hibridação com uma sonda marcada, por PCR, ou por digestão com enzimas de restrição e eletroforese em gel. (6) Sequencie o inserto. Uma biblioteca é a coleção de clones de um genoma ou transcriptoma inteiro, da qual qualquer gene pode ser pescado pela mesma triagem.

Um gel de agarose sob luz ultravioleta: os fragmentos de DNA migram rumo ao ânodo a uma velocidade que cai com o comprimento deles, de modo que cada banda é uma população de moléculas de um mesmo tamanho, comparada com a escada de tamanhos conhecidos nas raias externas.

Definição 6.3 (A reação em cadeia da polimerase)

A reação em cadeia da polimerase (PCR) amplifica um trecho escolhido de DNA entre dois iniciadores — oligonucleotídeos sintéticos de cerca de vinte bases complementares às duas fitas nas extremidades do alvo — por ciclos de três temperaturas: $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para separar as fitas, $50\text{ a }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para os iniciadores anelarem, $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para uma polimerase termoestável (a Taq, da bactéria de fontes termais Thermus aquaticus) estendê-los. Cada ciclo dobra o número de cópias do segmento entre os iniciadores, de modo que trinta ciclos convertem uma única molécula em um bilhão. A PCR de transcrição reversa primeiro copia o RNA em DNA e assim mede transcritos ou vírus de RNA; a PCR quantitativa (qPCR) acompanha a amplificação em tempo real com um corante fluorescente e lê a quantidade inicial a partir do ciclo em que o sinal cruza um limiar.

Teorema 6.4 (A aritmética da amplificação)

Com eficiência $E$ por ciclo ( $E = 1$ para uma duplicação perfeita), $N_{0}$ cópias iniciais se tornam

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

após $n$ ciclos. Se a fluorescência cruza um limiar fixo quando o número de cópias alcança $N_{T}$ , o ciclo limiar é

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

uma reta em $\log N_{0}$ com inclinação $-1/\log(1+E)$ : para $E = 1$ , cada aumento de dez vezes na quantidade inicial baixa o $C_{T}$ em $\log_{2} 10 = 3.32$ ciclos, e duas amostras cujos ciclos limiares diferem de $\Delta C_{T}$ diferem em cópias iniciais pelo fator $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ .

Demonstração. Cada ciclo multiplica o número de cópias por $1 + E$ , de modo que $N_{n}$ é uma progressão geométrica. Fazendo $N_{n} = N_{T}$ e resolvendo para $n$ obtém-se $C_{T}$ ; a inclinação é o coeficiente de $\log N_{0}$ . Para duas amostras, $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , de onde $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ . ∎

Exemplo 6.5 (Ler uma placa de qPCR)

Um teste de RNA viral cruza o limiar no ciclo $22$ num paciente e no ciclo $32$ em outro; com $E \approx 1$ o primeiro carrega $2^{10} \approx 1000$ vezes mais vírus. Uma amostra de dez cópias cruza por volta do ciclo $37$ quando o limiar é de $10^{12}$ cópias ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ); uma corrida de $40$ ciclos detecta, portanto, algumas poucas moléculas — e uma única molécula contaminante de um amplicon anterior também é detectada, e é por isso que os laboratórios separam as salas onde a PCR é montada daquelas em que os produtos são manipulados.

Curvas de amplificação para N_0 = 107 (azul), 104 (vermelho) e 10 cópias (verde), E = 1, com o platô que os reagentes impõem. Uma diferença de mil vezes em N_0 desloca o ciclo limiar em 10; os platôs são todos parecidos, e é por isso que o produto final nada diz sobre o início. — Curvas de amplificação para $N_{0} = 10^{7}$ (azul), $10^{4}$ (vermelho) e $10$ cópias (verde), $E = 1$ , com o platô que os reagentes impõem. Uma diferença de mil vezes em $N_{0}$ desloca o ciclo limiar em $10$ ; os platôs são todos parecidos, e é por isso que o produto final nada diz sobre o início.

6.2 Fazer proteínas

Definição 6.6 (Sistemas de expressão)

Um vetor de expressão põe a sequência codificadora clonada sob um promotor forte e controlável do hospedeiro (o promotor lac ou o T7 em E. coli, induzidos por um análogo de açúcar), com um sítio de ligação ao ribossomo, um terminador e, muitas vezes, uma etiqueta — seis histidinas, uma pequena proteína — fundida ao produto para purificação numa coluna. As bactérias produzem gramas por litro de uma proteína simples (insulina, hormônio de crescimento, enzimas), mas não conseguem glicosilar nem enovelar proteínas de mamífero complexas; a levedura acrescenta açúcares à sua própria maneira; células de inseto e de mamífero (as células de ovário de hamster chinês são o padrão da indústria) produzem anticorpos e fatores de coagulação enovelados e glicosilados como num humano. Um anticorpo monoclonal é feito por um hibridoma — um linfócito B produtor de anticorpo fundido a uma célula imortal de mieloma (Köhler e Milstein, 1975) — ou, hoje, clonando os genes do anticorpo numa linhagem de expressão de mamífero, em que o arcabouço murino pode ser substituído por sequência humana para evitar a rejeição imune (Capítulo 16).

Exemplo 6.7 (Insulina)

A insulina humana são duas cadeias, a A (21 resíduos) e a B (30), unidas por pontes dissulfeto e recortadas na célula $\beta$ a partir de um único precursor, a pró-insulina. O primeiro processo expressava as duas cadeias separadamente em E. coli, cada uma fundida à $\beta$ -galactosidase, clivava-as quimicamente e as unia in vitro; os processos posteriores expressam a pró-insulina e a clivam com as enzimas que o pâncreas usa. Desde 1996 a própria sequência vem sendo alterada: trocar ou acrescentar um resíduo ou dois dá análogos que se dissociam mais depressa (para uma refeição) ou que precipitam no local da injeção e se liberam ao longo de um dia. Uma proteína que exigia oito toneladas de glândulas por quilograma é hoje feita num fermentador, idêntica à humana ou melhor que ela.

6.3 Organismos transgênicos

Definição 6.8 (Transgênese e direcionamento gênico)

Um organismo transgênico carrega um gene introduzido em sua linhagem germinativa, de modo que toda célula o tem e ele é herdado. Nos camundongos a via clássica é a microinjeção do DNA num dos pronúcleos de um óvulo fecundado (Gordon e Ruddle, 1980), que se integra num sítio aleatório numa fração dos embriões; Palmiter e Brinster (1982) produziram camundongos do dobro do tamanho normal injetando o gene do hormônio de crescimento de rato atrás de um promotor de metalotioneína. O direcionamento gênico substitui ou rompe um gene escolhido: uma construção com braços longos homólogos ao alvo é introduzida em células-tronco embrionárias, as raras células em que a recombinação homóloga a pôs no lugar certo são selecionadas e injetadas num blastocisto, e o camundongo quimérico que daí resulta transmite o gene alterado (Capecchi, Smithies e Evans, anos 1980). Um nocaute não tem o gene; um knock-in carrega uma versão modificada; um alelo condicional, ladeado por sítios loxP, é deletado só onde e quando a Cre é expressa (Capítulo 3). Uns dez mil genes de camundongo já foram nocauteados e, para a maioria, o fenótipo foi a primeira indicação do que o gene faz.

À esquerda: um óvulo de camundongo fecundado, segurado por sucção enquanto uma agulha de vidro injeta DNA num dos pronúcleos. À direita: um camundongo transgênico que expressa em cada célula a proteína fluorescente verde de uma água-viva, ao lado de um irmão de ninhada comum, sob luz ultravioleta.

Definição 6.9 (Plantas transgênicas)

As plantas são transformadas por Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria do solo que naturalmente insere um segmento de seu plasmídeo indutor de tumor, o T-DNA, no genoma de uma planta ferida, para fazê-la produzir uma galha e alimentar a bactéria. Substituir os próprios genes do T-DNA por qualquer gene de escolha, entre as sequências de borda que a bactéria reconhece, converte o patógeno num vetor; as células transformadas são selecionadas e regeneradas em plantas inteiras, coisa que qualquer célula vegetal sabe fazer. As espécies que a bactéria não infecta (os cereais, por muito tempo) são transformadas disparando partículas de ouro recobertas de DNA no tecido. Os cultivos geneticamente modificados plantados em escala carregam um gene de toxina bacteriana (Bt) contra larvas de insetos, ou uma enzima bacteriana que confere tolerância a um herbicida, ou os dois; o Arroz Dourado carrega dois genes da via dos carotenoides (uma fitoeno-sintase vegetal e uma dessaturase bacteriana) para que seu endosperma produza $\beta$ -caroteno, o precursor da vitamina A, cuja deficiência cega e mata várias centenas de milhares de crianças por ano.

Arroz comum e Arroz Dourado. O grão amarelo produz -caroteno em seu endosperma a partir de dois genes acrescentados da via dos carotenoides. À direita: os dois arrozes comparados no Instituto Internacional de Pesquisa do Arroz (IRRI, CC BY 2.0). — Arroz comum e Arroz Dourado. O grão amarelo produz $\beta$ -caroteno em seu endosperma a partir de dois genes acrescentados da via dos carotenoides. À direita: os dois arrozes comparados no Instituto Internacional de Pesquisa do Arroz (IRRI, CC BY 2.0).

Observação 6.10 (O debate)

Trinta anos de cultivo em centenas de milhões de hectares, e cada revisão sistemática feita pelas academias científicas, não encontraram efeito sobre a saúde dos cultivos transgênicos aprovados que difira do de suas contrapartes convencionais; o transgene é mais um gene entre quarenta mil, e a proteína que ele produz é testada como qualquer aditivo alimentar. As questões reais são ecológicas e econômicas: a propagação de resistência em pragas e ervas daninhas sob seleção uniforme, o fluxo gênico para parentes silvestres, a concentração do mercado de sementes e quem se beneficia. São as questões que qualquer tecnologia agrícola poderosa levanta, e as respostas dependem da característica e do contexto, não do método pelo qual o gene foi movido.

6.4 Editar genomas

Definição 6.11 (CRISPR–Cas9)

As bactérias guardam fragmentos dos genomas dos fagos que infectaram seus ancestrais num arranjo de repetições (CRISPR), transcrevem-nos em RNAs-guia curtos e os usam para dirigir uma nuclease ao corte de qualquer DNA correspondente que entre na célula: um sistema imune adaptativo com memória genética. Em Streptococcus pyogenes a nuclease é a proteína única Cas9, que se liga a um RNA-guia e a um segundo RNA pequeno, procura no DNA um motivo adjacente ao protoespaçador de três bases (PAM, 5 $'$ -NGG), desenrola o DNA adjacente e, se as vinte bases ao lado do PAM parearem com o guia, corta as duas fitas a três bases do PAM. Jinek, Charpentier, Doudna e colaboradores (2012) fundiram os dois RNAs num único RNA-guia único e mostraram que a Cas9 com um guia de sequência qualquer corta o DNA naquela sequência num tubo de ensaio; em menos de um ano o par já funcionava em células humanas, de camundongo, de peixe-zebra, de planta e de levedura. A edição de genomas é o que a célula faz com o corte: a junção de extremidades deixa uma pequena inserção ou deleção que rompe o gene (um nocaute numa única etapa, em qualquer organismo, em semanas), e a recombinação homóloga com um molde fornecido escreve ali uma sequência escolhida.

A Cas9 e seu guia. A proteína liga um PAM, desenrola o DNA ao lado dele e corta se as vinte bases parearem com o RNA-guia. A quebra é reparada ou por junção de extremidades, que rompe o gene, ou por recombinação com um molde, que o reescreve.

Proposição 6.12 (Editar sem quebra)

Cortar as duas fitas é a edição mais grosseira: o desfecho da junção de extremidades é aleatório, e uma quebra em outro lugar — um sítio fora do alvo, que difere do guia em algumas posições e que a Cas9 tolera — é uma mutação que ninguém pediu. Uma Cas9 com um domínio nuclease inativado corta uma só fita; com os dois inativados ela apenas se liga, e pode levar outras enzimas até uma sequência. Os editores de bases fundem uma Cas9 cortadora de uma fita a uma desaminase que converte C em U (lido como T) ou A em I (lido como G) na fita desenrolada, mudando uma base sem quebra e sem molde; os editores prime carregam uma transcriptase reversa e um guia estendido com a sequência desejada, e copiam essa sequência para dentro da fita cortada, o que permite qualquer substituição e pequenas inserções ou deleções. A atividade fora do alvo é reduzida por variantes de Cas9 de alta fidelidade, entregando a enzima brevemente como proteína em vez de gene, e escolhendo guias cujos parentes genômicos mais próximos difiram em várias posições; ela é medida sequenciando os sítios previstos e por métodos não enviesados que captam toda quebra no genoma.

Exemplo 6.13 (Uma cura)

A doença falciforme é uma única troca de base na $\beta$ -globina. A hemoglobina fetal, feita de $\gamma$ -globina, a substituiria, mas os genes $\gamma$ são desligados depois do nascimento pelo repressor BCL11A. A primeira terapia CRISPR aprovada (2023) toma as células-tronco do sangue do próprio paciente, corta com a Cas9 o intensificador eritroide do BCL11A para que a junção de extremidades o inutilize na maioria das células, e devolve as células depois que a medula do paciente foi esvaziada: as hemácias que elas produzem são ricas em hemoglobina fetal, não falcizam, e as crises cessam. A edição é somática — a linhagem germinativa fica intocada e a mudança não é herdada — e usa o desfecho “grosseiro”, a ruptura, justamente onde a ruptura é o que se quer.

Teorema 6.14 (Propagação super-mendeliana de um impulsor gênico)

Um impulsor gênico é uma construção que codifica a Cas9 e um guia que corta o alelo selvagem em seu próprio loco num heterozigoto; o reparo por recombinação copia o impulsor para o cromossomo cortado, de modo que uma fração $c$ dos gametas do heterozigoto carrega o impulsor em vez da metade mendeliana. Se o impulsor tem frequência $p$ numa população grande e de acasalamento aleatório, e não tem custo de adequação, sua frequência na geração seguinte é

p' = p + c\,p\,(1 - p),

de modo que ele se propaga a partir da raridade a uma taxa proporcional a $c$ e alcança metade da população em cerca de $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ gerações a partir de uma frequência inicial $p_{0}$ .

Demonstração. O acasalamento aleatório dá homozigotos para o impulsor à frequência $p^{2}$ , heterozigotos a $2p(1-p)$ e homozigotos selvagens a $(1-p)^{2}$ . Os homozigotos transmitem o impulsor a todos os seus gametas, os heterozigotos a uma fração $(1 + c)/2$ (metade por Mendel, mais $c$ vezes a metade selvagem convertida), e os selvagens a nenhum. Logo, $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ . Para $p$ pequeno isso é $p' \approx (1+c)p$ , um crescimento geométrico de razão $1 + c$ , que alcança $1/2$ a partir de $p_{0}$ após cerca de $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ gerações; o termo logístico só o desacelera perto do fim. ∎

Um impulsor gênico liberado a um por cento, com eficiência de conversão 0.9 ou 0.5 e sem custo de adequação. Um alelo mendeliano sem vantagem ficaria em um por cento; o impulsor domina em dez ou vinte gerações. — Um impulsor gênico liberado a um por cento, com eficiência de conversão $0.9$ ou $0.5$ e sem custo de adequação. Um alelo mendeliano sem vantagem ficaria em um por cento; o impulsor domina em dez ou vinte gerações.

Observação 6.15 (O que se pode editar)

Editar as células somáticas de um paciente que consente é medicina, julgada como qualquer tratamento por seus riscos e benefícios. Editar a linhagem germinativa — um embrião, cujo descendente carregaria a mudança — é diferente em natureza: a pessoa afetada não pode consentir, a mudança é herdada, e os desfechos fora do alvo e em mosaico da técnica ainda não estão controlados; depois que um cientista chinês anunciou, em 2018, tê-lo feito em gêmeas, as academias científicas da maioria dos países pediram uma moratória e vários Estados criminalizaram a prática. Um impulsor gênico liberado numa população silvestre é uma decisão tomada por todos os que vêm depois, e é por isso que as próprias propostas da área para eliminar os mosquitos da malária acoplam os impulsores a salvaguardas — impulsores de reversão, projetos autolimitados — e ao consentimento público dos países envolvidos.

6.5 Exercícios

Exercício 6.1 ★

Liste os três componentes que um plasmídeo de clonagem precisa ter e explique a finalidade de cada um.

Solução

Solução de Exercício 6.1.

Uma origem de replicação, para que o hospedeiro copie o plasmídeo e o passe às células-filhas; um marcador de seleção, em geral de resistência a antibiótico, para que só cresçam as células que carregam o plasmídeo; e um sítio de restrição único (ou um agrupamento de sítios) em que o inserto é ligado sem cortar o plasmídeo em outro lugar.

Exercício 6.2 ★

A EcoRI reconhece GAATTC. Com que frequência o sítio ocorre, em média, em DNA aleatório, e quantos fragmentos ele faz do genoma de $4.6\,\mathrm{Mb}$ de E. coli? Por que o número real é um pouco diferente?

Solução

Solução de Exercício 6.2.

Uma dada sequência de seis bases ocorre uma vez a cada $4^{6} = 4096$ bp em DNA aleatório: cerca de $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ fragmentos de $4.1\,\mathrm{kb}$ em média. Os genomas reais não são aleatórios — a composição de bases, o uso de códons e a evitação de algumas sequências deslocam a contagem (o número real de sítios EcoRI em E. coli é de várias centenas).

Exercício 6.3 ★

Enuncie as três etapas de temperatura de um ciclo de PCR e o que acontece em cada uma. Por que a polimerase precisa ser termoestável?

Solução

Solução de Exercício 6.3.

A desnaturação a $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ separa as fitas; o anelamento a $50\text{ a }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ deixa os iniciadores parearem com seus sítios; a extensão a $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ deixa a polimerase copiar a partir de cada iniciador. Uma polimerase comum seria destruída a $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ já no primeiro ciclo e teria de ser acrescentada de novo trinta vezes; a Taq sobrevive a todos os ciclos.

Exercício 6.4 ★

De que a Cas9 precisa para cortar uma dada sequência, e que dois desfechos podem seguir-se ao corte?

Solução

Solução de Exercício 6.4.

Um RNA-guia cujas vinte bases correspondam ao alvo, e um PAM (NGG) imediatamente a 3 $'$ do alvo na fita não alvo. Depois da quebra de fita dupla: a junção de extremidades, que deixa uma pequena inserção ou deleção e em geral destrói a fase de leitura do gene; ou a recombinação homóloga com um molde que carrega a sequência desejada, que a escreve ali.

Exercício 6.5 ★★

Uma PCR roda $35$ ciclos com eficiência $E = 0.9$ a partir de $50$ cópias. Quantas cópias resultam? Uma qPCR de duas amostras dá $C_{T} = 18.2$ e $25.5$ ; com $E = 0.95$ , qual é a razão entre suas quantidades iniciais?

Solução

Solução de Exercício 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ cópias. $\Delta C_{T} = 7.3$ ; razão $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : a primeira amostra tinha cerca de $130$ vezes mais molde.

Exercício 6.6 ★★

Por que se usa uma biblioteca de cDNA, e não uma biblioteca genômica, para expressar uma proteína humana em bactérias? Nomeie dois outros obstáculos a fazer uma proteína humana em E. coli e diga como cada um é superado.

Solução

Solução de Exercício 6.6.

As bactérias não fazem splicing: uma cópia genômica com íntrons seria transcrita num mensageiro inutilizável, e por isso se usa o cDNA sem íntrons, copiado do mRNA maduro. Outros obstáculos: o promotor humano não é reconhecido pela polimerase bacteriana (forneça um promotor bacteriano e um sítio de ligação ao ribossomo); o uso de códons humano é diferente (sintetize o gene com os códons preferidos do hospedeiro); a proteína pode não se enovelar ou pode se agregar (baixe a temperatura, funda-a a um parceiro solúvel ou reenovele-a a partir dos corpos de inclusão); a glicosilação está ausente (use levedura ou células de mamífero se ela importar); as pontes dissulfeto precisam do periplasma oxidante.

Exercício 6.7 ★★

Um camundongo nocaute é feito por direcionamento gênico em células-tronco embrionárias. Explique por que o primeiro camundongo nascido é uma quimera, por que é preciso cruzá-lo, e que fração dos netos de uma quimera cuja linhagem germinativa é metade direcionada são nocautes homozigotos se os avós heterozigotos forem intercruzados.

Solução

Solução de Exercício 6.7.

As células-tronco direcionadas são injetadas num blastocisto hospedeiro e se misturam com as células dele, de modo que o camundongo é construído a partir de dois genótipos — uma quimera — e só transmite o alelo se algumas de suas células germinativas derivarem das células direcionadas. Cruzar a quimera com um camundongo selvagem dá heterozigotos (vindos de metade de seus gametas, se metade da linhagem germinativa for direcionada); intercruzar heterozigotos dá um quarto de nocautes homozigotos.

Exercício 6.8 ★★

Escolhe-se um RNA-guia de 20 bases com um PAM NGG. Quantos sítios de um genoma de $3.2\times 10^{9}$ bp (as duas fitas) correspondem ao guia exatamente por acaso? Quantos correspondem com até duas discordâncias, se a Cas9 as tolera? (Conte as sequências a até duas discordâncias como $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ .)

Solução

Solução de Exercício 6.8.

Exatas: $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ sítio (o GG do PAM custa um fator $16$ ) — nenhum, na prática. A até duas discordâncias há $1 + 60 + 1710 = 1771$ sequências: $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ sítio de acaso. O genoma real não é aleatório, e um guia é conferido diretamente contra ele.

Exercício 6.9 ★★

Usando o Teorema 6.14, calcule a frequência de um impulsor com $c = 0.8$ após três gerações a partir de $p_{0} = 0.05$ , e estime o número de gerações para alcançar $0.5$ .

Solução

Solução de Exercício 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; depois $0.41$ , $0.60$ : cerca de cinco gerações para passar de $0.5$ , contra a estimativa $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ .

Exercício 6.10 ★★★

A terapia da doença falciforme rompe um intensificador em vez de corrigir a mutação da $\beta$ -globina. Dê duas razões pelas quais a ruptura por junção de extremidades foi escolhida em vez da correção por recombinação homóloga em células-tronco do sangue, e uma desvantagem.

Solução

Solução de Exercício 6.10.

A junção de extremidades age em cada célula, inclusive nas células-tronco quiescentes, em que a recombinação homóloga, um processo de S/G2, é ineficiente; ela não exige a entrega de um molde e seu produto — qualquer ruptura do intensificador — resolve o problema, ao passo que a correção exige a sequência exata e rende uma minoria de células. Além disso, a mesma edição serve para qualquer mutação da $\beta$ -globina, falciforme ou talassêmica. Desvantagem: ela remove um elemento regulatório (com quaisquer outros papéis que ele tenha), deixa o alelo falciforme no lugar e a mistura de indels fica sem controle.

Exercício 6.11 ★★★

Um impulsor gênico contra um mosquito tem custo de adequação $s$ nos homozigotos. Modifique a recorrência para incluir a seleção contra os homozigotos do impulsor e determine a condição sobre $c$ e $s$ para que o impulsor se propague a partir da raridade. Depois explique por que os alelos de resistência — produtos de junção de extremidades no alvo que o guia já não reconhece — são o principal obstáculo na prática.

Solução

Solução de Exercício 6.11.

Com adequação $1 - s$ nos homozigotos: $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ . A partir da raridade, os homozigotos são desprezíveis e o impulsor cresce como $(1+c)p$ seja qual for $s$ ; se ele vai à fixação decide-se perto de $p = 1$ , onde um alelo selvagem raro de frequência $q$ retorna como $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ : há fixação se $c > s$ , e um equilíbrio intermediário em caso contrário. Resistência: cada conversão que falha (junção de extremidades em vez de recombinação) deixa um alelo que o guia já não reconhece; se esses alelos forem aptos — um indel em fase numa região não essencial — eles não têm custo algum enquanto o impulsor tem, de modo que a seleção os favorece e eles substituem o impulsor. Os remédios são mirar sequências essenciais em que os indels sejam letais e usar vários guias ao mesmo tempo.

Exercício 6.12 ★★★

Argumente, com os mecanismos deste capítulo e do Capítulo 3, por que a edição germinativa de um embrião humano não consegue hoje garantir o desfecho pretendido em cada célula, e que evidência seria necessária antes que uma pessoa racional pudesse considerá-la segura.

Solução

Solução de Exercício 6.12.

A Cas9 injetada num zigoto pode agir depois das primeiras divisões, de modo que células diferentes recebem reparos diferentes — o mosaicismo; o reparo de cada quebra é escolhido pela célula, com a junção de extremidades dando indels imprevisíveis e deleções grandes ou perda de heterozigosidade no corte; o desfecho por recombinação homóloga é minoritário; quebras fora do alvo ocorrem em sítios que não se pode prever todos; e o embrião só pode ser conferido sequenciando algumas células biopsiadas, que não podem falar pelas demais. Evidência necessária: métodos que editem cada célula de modo idêntico (antes da primeira fase S) com eficiências próximas de $100\,\%$ , sequenciamento do genoma inteiro de cada célula de embriões animais editados mostrando nenhuma mudança não intencional, e acompanhamento de longo prazo de animais editados ao longo de gerações — nada do que existe hoje.

6.6 Problema: de um gene a um fármaco e a uma lavoura

Problema 6.1

Problema de fim de semana — um gene clonado com a aritmética dos sítios de restrição e da transformação, um vírus contado por qPCR, um hormônio produzido às toneladas num fermentador, um genoma editado com seus efeitos fora do alvo contados e um impulsor gênico cronometrado, terminando nas cópias de um vírus numa amostra, no volume anual de fermentador para a insulina do mundo e no número de gerações de que um impulsor precisa

Dados: um gene de $1.5\,\mathrm{kb}$ ; um sítio de restrição de seis bases; um plasmídeo de $4\,\mathrm{kb}$ ; eficiência de transformação de $2\times 10^{7}$ colônias por micrograma de plasmídeo; a ligação dá inserto a $10\,\%$ dos plasmídeos. Eficiência da qPCR $E = 1$ , limiar $N_{T} = 10^{12}$ . Insulina: $5.8\,\mathrm{kDa}$ , um paciente usa $40$ unidades por dia, sendo uma unidade $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ ; $10^{7}$ pacientes; um fermentador rende $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de produto por lote, dez lotes por ano. Genoma $3.2\times 10^{9}$ bp. Conversão do impulsor $c = 0.9$ , liberado a $p_{0} = 0.001$ .

Parte I — Clonagem.

Com que frequência um dado sítio de seis bases ocorre em DNA aleatório? Qual é a probabilidade de o gene de $1.5\,\mathrm{kb}$ não conter nenhum sítio desses, de modo que a enzima possa ser usada para cloná-lo inteiro?
Se ele contiver um sítio, como você o clonaria mesmo assim? (Dois métodos.)
$100\,\mathrm{ng}$ de plasmídeo ligado são transformados. Quantas colônias, e quantas carregam o inserto?
Usa-se a triagem azul–branco. Que fração das colônias é branca, e quantas colônias brancas é preciso pescar para ter $99\,\%$ de chance de ao menos uma carregar o gene na orientação certa (metade dos insertos)?
O plasmídeo recombinante tem $5.5\,\mathrm{kb}$ . Uma célula contém $50$ cópias e se divide a cada $30\,\mathrm{min}$ . Depois de um crescimento de uma noite ( $16\,\mathrm{h}$ ) a partir de uma célula, quantas moléculas de plasmídeo e que massa de DNA plasmidial ( $650\,\mathrm{Da}$ por par de bases)?
Por que o plasmídeo precisa de uma origem bacteriana, ao passo que o gene humano inserido não precisa de promotor bacteriano para a clonagem, mas precisa para a expressão?

Parte II — Contar um vírus.

A amostra de um paciente cruza o limiar em $C_{T} = 28$ . Quantas cópias havia na reação? E outra em $C_{T} = 35$ ?
Sensibilidade: quantos ciclos são necessários para levar uma única cópia ao limiar?
O ponto de corte do teste é fixado em $C_{T} = 38$ . A que número de cópias isso corresponde, e por que não usar $45$ ciclos?
Uma molécula contaminante do produto de uma corrida anterior entra numa amostra negativa. Em que ciclo ela cruza o limiar? Que prática de laboratório impede isso?
A transcrição reversa converte $40\,\%$ do RNA viral em DNA. Corrija a contagem da questão 7 para a primeira amostra.
Duas amostras diferem em $\Delta C_{T} = 3.3$ com $E = 1$ , mas a eficiência é na verdade $0.9$ . Que diferença em vezes o analista relata, e qual é a verdadeira?

Parte III — Insulina às toneladas.

Calcule a massa diária de insulina por paciente e a necessidade anual do mundo para $10^{7}$ pacientes, em quilogramas.
Quantos mols de insulina são esses, e quantas moléculas?
Que volume de fermentador, rodado dez lotes por ano, produz isso? Compare com uma piscina de $2500\,\mathrm{m}^{3}$ .
A extração de glândulas dava $1\,\mathrm{kg}$ de insulina por $8000\,\mathrm{kg}$ de pâncreas; um pâncreas de porco pesa $100\,\mathrm{g}$ . De quantos porcos por ano o mundo precisaria?
Por que o hormônio recombinante é preferido mesmo onde a insulina animal é barata? Dê duas razões.
Os análogos de insulina diferem da sequência humana em um ou dois resíduos. Explique por que um análogo ainda é um fármaco que age sobre o receptor humano, e por que a troca de um resíduo pode alterar seu tempo de dissociação.

Parte IV — Editar e impulsionar.

Quantas correspondências exatas de um guia de 20 bases mais NGG o genoma contém por acaso (as duas fitas: $6.4\times 10^{9}$ posições)?
Se a Cas9 tolera até três discordâncias, quantas sequências estão a até três discordâncias do guia, e quantos sítios fora do alvo de acaso daí resultam?
As células-tronco do sangue editadas são $10^{7}$ ; $80\,\%$ carregam a ruptura pretendida. Quantas células carregam uma quebra fora do alvo num dado sítio, se ele é cortado numa célula em $10^{4}$ , e por que uma quebra num gene supressor de tumor numa única célula-tronco é motivo de preocupação?
Calcule a frequência do impulsor após $1, 2, 3$ gerações a partir de $p_{0} = 0.001$ , e estime as gerações até $0.5$ .
Um mosquito tem dez gerações por ano. Quantos anos para dominar? Como um custo de adequação de $20\,\%$ nos homozigotos muda o quadro qualitativamente?
Um alelo de resistência surge quando a junção de extremidades, e não a recombinação, repara o corte, com probabilidade $1 - c = 0.1$ por tentativa de conversão. Estime o número de alelos de resistência criados numa população de $10^{6}$ heterozigotos em uma geração, e explique o que acontece com o impulsor se eles forem aptos.
Resuma: as cópias na primeira amostra (questão 7), o volume anual de fermentador para a insulina do mundo (questão 15) e as gerações para o impulsor alcançar metade da população (questão 22).

Solução

Solução de Problema 6.1.

1. Uma vez a cada $4096$ bp. $P(\text{sem sítio}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ . 2. Escolha uma enzima sem sítio no gene; ou amplifique o gene por PCR com iniciadores que carreguem novos sítios de restrição em suas extremidades 5 $'$ (ou use clonagem de extremidades cegas ou independente de ligação). 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ colônias; $10\,\%$ , ou $2\times 10^{5}$ , carregam o inserto. 4. Brancas: $10\,\%$ . Metade dos insertos está na orientação certa, de modo que $P(\text{nenhum em } n \text{ brancas}) = 0.5^{n} \le 0.01$ dá $n \ge 6.6$ : pesque sete. 5. $32$ duplicações, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ células, $2.1\times 10^{11}$ plasmídeos; cada um com $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g: $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ de plasmídeo. 6. A clonagem só precisa de replicação, fornecida pela origem do plasmídeo; o promotor humano não é lido pela RNA-polimerase bacteriana, de modo que, para a expressão, um promotor bacteriano e um sítio de ligação ao ribossomo precisam ser postos à frente da sequência codificadora (sem íntrons). 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ cópias; em $C_{T} = 35$ , $10^{12}/2^{35} \approx 29$ cópias. 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , quarenta ciclos. 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ cópias. Além de uns $40$ ciclos, uma única molécula contaminante, ou artefatos de iniciador, alcançam o limiar, e uma amostra de menos de uma cópia não significa nada. 10. Uma molécula cruza no ciclo $40$ : um positivo. Impeça isso com salas e equipamentos separados para a montagem e para a manipulação dos produtos, fluxo de trabalho de mão única, controles negativos em toda corrida e destruição enzimática dos amplicons arrastados. 11. $3700/0.4 \approx 9000$ cópias de RNA. 12. Relatado $2^{3.3} \approx 10$ vezes; verdadeiro $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ vezes. 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ por dia, $0.51\,\mathrm{g}$ por ano; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ por ano. 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol; $5.3\times 10^{26}$ moléculas. 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — um décimo da piscina. 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg de pâncreas, a $0.1\,\mathrm{kg}$ cada: $4\times 10^{8}$ porcos por ano. 17. O hormônio recombinante é idêntico ao humano, e por isso não suscita anticorpos nem causa reações alérgicas; não carrega patógenos animais (vírus, príons); o abastecimento não depende do abate; e a sequência pode ser aprimorada. 18. Os resíduos que tocam o receptor ficam inalterados, de modo que a ligação e a sinalização são as da insulina; os resíduos alterados ficam na superfície em que as moléculas de insulina se associam em dímeros e hexâmeros, e mudá-los muda a rapidez com que o depósito injetado se desfaz em monômeros absorvíveis. 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : nenhuma correspondência exata de acaso. 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ sequências; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ sítios fora do alvo de acaso. 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ células. Uma célula-tronco vive e se divide por toda a vida do paciente; uma que tenha perdido um supressor de tumor, ou adquirido uma translocação, pode fundar um clone que se torna uma leucemia. 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; um crescimento geométrico de $1.9$ por geração dá $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ ; iterando a recorrência, a frequência passa de $0.5$ na geração $11$ ( $0.45 \to 0.68$ ). 23. Cerca de um ano. Um custo de $20\,\%$ nos homozigotos é menor que $c = 0.9$ , de modo que o impulsor ainda vai à fixação, mais devagar, enquanto a adequação média da população cai — que é justamente o propósito de um impulsor de supressão; um custo acima de $c$ o deteria numa frequência intermediária. 24. $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ alelos de resistência em uma geração. Sendo incortáveis e, se aptos, sem custo enquanto o impulsor tem custo, eles são favorecidos e se propagam, e o impulsor é eliminado — por isso os impulsores miram sítios em que os produtos de junção de extremidades sejam letais, com vários guias ao mesmo tempo. 25. Cerca de $3700$ cópias na primeira amostra; uns $260\,\mathrm{m}^{3}$ de fermentador por ano para a insulina do mundo; cerca de $11$ gerações, um ano de mosquito, para o impulsor.

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