Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

13Virologia

Há uns $10^{31}$ partículas de vírus na Terra, dez para cada célula, e no mar elas matam um quinto de todas as bactérias por dia. Um vírus não é uma célula: não tem metabolismo, não tem ribossomos, não tem como fazer nada sozinho. É um genoma — tão curto quanto dois genes, tão longo quanto dois mil — envolto num casco de proteína, que entra numa célula e volta a maquinaria dela para fazer cópias de si mesmo. A gripe de 1918 matou cinquenta milhões de pessoas; a varíola, que matou trezentos milhões só no século XX, foi erradicada em 1980 por uma vacina experimentada pela primeira vez em 1796; e um coronavírus que passou aos humanos em 2019 teve seu genoma sequenciado em semanas, uma vacina desenhada poucos dias depois disso e fármacos contra sua protease em dois anos. Este capítulo trata do que são os vírus e de como são classificados pela química de seus genomas, de como se multiplicam, da cinética de uma infecção dentro de um hospedeiro — que um par de equações diferenciais descreve bem o bastante para ter mudado o tratamento da aids —, de sua evolução e de como são combatidos.

13.1 O que é um vírus

Definição 13.1 (Vírus)

Um vírus é um parasito intracelular obrigatório constituído de um genoma de ácido nucleico — DNA ou RNA, de fita simples ou dupla, linear ou circular, uma molécula ou várias — empacotado num capsídeo proteico e, em muitos casos, envolto num envelope tomado de uma membrana do hospedeiro e cravejado de glicoproteínas virais. A partícula infecciosa completa é o vírion, de $20\text{ a }300\,\mathrm{nm}$ na maioria (uns poucos vírus gigantes chegam a um micrômetro). Os capsídeos são construídos de muitas cópias de uma ou de umas poucas proteínas dispostas com simetria helicoidal (um bastão, como no vírus do mosaico do tabaco) ou icosaédrica (um casco de $60T$ subunidades, $T = 1, 3, 4, 7,\dots$ ). A classificação de Baltimore agrupa os vírus pela rota do genoma até o RNA mensageiro: I, DNA de fita dupla (herpes, varíola, adenovírus, a maioria dos fagos); II, DNA de fita simples (parvovírus); III, RNA de fita dupla (rotavírus); IV, RNA de fita positiva, ele próprio um mensageiro (poliovírus, hepatite C, os coronavírus); V, RNA de fita negativa, complementar ao mensageiro (influenza, sarampo, raiva, Ebola); VI, RNA transcrito reversamente em DNA (os retrovírus, o HIV); VII, DNA replicado por um intermediário de RNA (hepatite B). Toda classe exceto a I precisa trazer ou codificar uma enzima que a célula não tem — uma RNA-polimerase dependente de RNA, uma transcriptase reversa —, e essas enzimas são os alvos da maioria dos antivirais.

Evidência. Ivanovsky (1892) e Beijerinck (1898) mostraram que a doença do mosaico do tabaco era transmitida por seiva passada por filtros que retinham todas as bactérias — um contagium vivum fluidum, um fluido infeccioso vivo. Stanley (1935) cristalizou o agente, o vírus do mosaico do tabaco, e mostrou que ele era proteína com (como Bawden e Pirie descobriram) $5\,\%$ de RNA. Hershey e Chase (1952) marcaram a proteína de um bacteriófago com $^{35}$ S e seu DNA com $^{32}$ P, deixaram-no infectar E. coli, arrancaram os cascos vazios num liquidificador e encontraram o $^{32}$ P dentro das células e o $^{35}$ S fora: o DNA entra e a proteína fica para trás, de modo que é o DNA que carrega as instruções. Fraenkel-Conrat (1955) desmontou o vírus do mosaico do tabaco em proteína e RNA e remontou partículas infecciosas com o RNA de uma linhagem e a proteína de outra; a prole era da linhagem do RNA. ∎

Proposição 13.2 (Economia genética: por que os capsídeos são simétricos)

Um capsídeo precisa encerrar o genoma que o codifica. Uma proteína de massa $m$ precisa de cerca de $m/110\,\mathrm{Da}$ códons, isto é, de $3m/110$ nucleotídeos, um trecho de RNA que pesa cerca de $3m/110\times330\,\mathrm{Da} = 9m$ : qualquer proteína é codificada por um ácido nucleico nove vezes mais pesado que ela. Um casco feito de uma única molécula de proteína que encerrasse um genoma teria de encerrar um genoma nove vezes mais pesado que ele apenas para codificar-se, e um casco não consegue conter nove vezes sua própria massa de ácido nucleico em densidade biológica. A saída, vista por Crick e Watson (1956), é construir o casco com muitas cópias de uma proteína pequena: o vírus do mosaico do tabaco codifica uma proteína de casco de $17.5\,\mathrm{kDa}$ em $480\,\mathrm{nt}$ de seu genoma de $6400\,\mathrm{nt}$ e usa $2130$ cópias dela. Subunidades idênticas que se empacotam de modo idêntico precisam estar dispostas simetricamente, e por isso os capsídeos virais são hélices ou icosaedros; a mesma economia lhes dá a capacidade de automontagem, já que cada subunidade só precisa reconhecer suas vizinhas.

Demonstração. A razão de massas decorre de um códon ser três nucleotídeos de cerca de $330\,\mathrm{Da}$ cada e um resíduo cerca de $110\,\mathrm{Da}$ : $3\times 330/110 = 9$ . Um capsídeo de uma única proteína de $40\,\mathrm{MDa}$ encerraria $360\,\mathrm{MDa}$ de ácido nucleico, uma esfera de raio de cerca de $50\,\mathrm{nm}$ na densidade de ácido nucleico, ao passo que a própria proteína faria um casco de cerca de $2\,\mathrm{nm}$ de espessura e do mesmo raio — geometricamente possível, mas um único polipeptídeo de $360\,000$ resíduos que se enovelasse corretamente não é, e uma mutação o destruiria. Com $n$ subunidades idênticas, o custo de codificação cai por $n$ e o volume encerrado não muda. ∎

As sete classes de Baltimore, ordenadas pela rota do genoma até o RNA mensageiro. Toda classe, exceto a I, precisa de uma enzima que a célula hospedeira não fornece — o alvo natural de um antiviral.

À esquerda: bacteriófagos presos por suas fibras caudais a uma bactéria, com cada cabeça sendo um capsídeo icosaédrico de DNA. À direita: vírions de influenza, envelopados, com a superfície feita de uma franja de espículas de hemaglutinina e neuraminidase.

13.2 Como um vírus se multiplica

Definição 13.3 (O ciclo de replicação)

Todo vírus passa pelas mesmas etapas. A adesão a um receptor específico do hospedeiro — o CD4 e um receptor de quimiocina para o HIV, a ACE2 para os coronavírus da SARS, o ácido siálico para a influenza, um lipopolissacarídeo ou uma porina para um fago —, que decide quais espécies e quais células o vírus pode infectar (seu tropismo). A entrada: a fusão do envelope com a membrana plasmática, ou a endocitose seguida de fusão de dentro do endossomo ácido, ou, para um fago, a injeção do genoma através da parede. O desnudamento, a expressão dos genes virais pela rota específica da classe, e a replicação do genoma, muitas vezes numa fábrica que o vírus constrói no citoplasma ou no núcleo. A montagem de novos capsídeos em torno de novos genomas, impulsionada pela automontagem das subunidades simétricas, e a liberação: por lise da célula, ou por brotamento através de uma membrana, que fornece o envelope. Alguns vírus podem, em vez disso, inserir seu genoma no do hospedeiro e esperar: a lisogenia do fago $\lambda$ , cujo repressor o mantém silencioso até que o hospedeiro seja danificado; a latência dos herpesvírus em neurônios por uma vida inteira e a do HIV como provírus em linfócitos T em repouso, de onde nenhum fármaco que aja sobre a replicação o remove.

O ciclo de replicação de um vírus envelopado: adesão a um receptor, entrada e desnudamento, expressão e replicação na maquinaria do hospedeiro, montagem e liberação por brotamento — ou, no caso de um retrovírus, integração no genoma do hospedeiro e silêncio.

Método 13.4 (Contar partículas infecciosas: o ensaio de placas)

Para medir um estoque de vírus: (1) dilua-o em passos de dez vezes; (2) misture cada diluição a um excesso de células hospedeiras — bactérias em ágar mole para um fago, uma monocamada de células em cultura para um vírus animal; (3) incube: cada partícula infecciosa infecta uma célula, a prole infecta as vizinhas, e depois de um ou dois dias um buraco claro, uma placa, marca o ponto; (4) conte as placas numa placa de Petri que tenha de $30\text{ a }300$ e multiplique pela diluição: é o título em unidades formadoras de placa (UFP) por mililitro. Como cada placa é um clone de uma partícula, colhê-la dá um isolado puro. A razão entre partículas físicas (contadas por microscopia eletrônica ou PCR) e unidades formadoras de placa costuma estar bem acima de um — de dez a mil para muitos vírus animais —, já que a maioria das partículas é defeituosa ou não consegue infectar.

À esquerda: placas num gramado bacteriano, cada uma uma zona clara em que a prole de um fago lisou as células ao redor. À direita: partículas de HIV brotando de um linfócito T, tomando seu envelope da membrana da célula.

Teorema 13.5 (Dinâmica da infecção dentro de um hospedeiro)

Sejam $T$ a densidade de células-alvo suscetíveis, $I$ a de células infectadas e $V$ a de vírions livres. Os vírions infectam alvos à taxa $\beta TV$ , as células infectadas produzem vírions à taxa $p$ cada uma e morrem à taxa $\delta$ , e os vírions livres são depurados à taxa $c$ :

\frac{\mathrm{d}I}{\mathrm{d}t} = \beta TV - \delta I, \qquad \frac{\mathrm{d}V}{\mathrm{d}t} = pI - cV .

Com $T$ mantido constante, a infecção cresce se o número básico de reprodução $R_{0} = \beta Tp/(c\delta)$ exceder $1$ , e no estado estacionário $V^{*} = p I^{*}/c$ , com a produção equilibrando a depuração. Se um fármaco interrompe todas as novas infecções em $t = 0$ ( $\beta \to 0$ ), os vírions decaem no início à taxa de depuração $c$ e depois, uma vez que o vírus livre tenha caído ao nível que as células infectadas restantes sustentam, à taxa de morte $\delta$ dessas células:

V(t) \approx V_{0}\,\frac{c\,e^{-\delta t} - \delta\,e^{-ct}}{c - \delta} \;\longrightarrow\; V_{0}\,\frac{c}{c-\delta}\,e^{-\delta t} \quad (t \gg 1/c).

As duas inclinações da carga viral depois do tratamento medem $c$ e $\delta$ , e $pI^{*} = cV^{*}$ dá a produção diária de vírions antes do tratamento.

Demonstração. Uma célula infectada vive em média $1/\delta$ e faz $p/\delta$ vírions; cada vírion vive $1/c$ e infecta $\beta T/c$ células nesse tempo; o produto é o número de células infectadas a que uma célula infectada dá origem, o $R_{0}$ . No estado estacionário, $\mathrm{d}V/\mathrm{d}t = 0$ dá $V^{*} = pI^{*}/c$ . Depois do tratamento, $\mathrm{d}I/\mathrm{d}t = -\delta I$ , de modo que $I = I_{0}e^{-\delta t}$ , e $\mathrm{d}V/\mathrm{d}t = pI_{0}e^{-\delta t} - cV$ é uma equação linear cuja solução com $V(0) = V_{0} = pI_{0}/c$ é a expressão dada (confira: em $t = 0$ ela vale $V_{0}$ , e satisfaz a equação termo a termo). Para $t \gg 1/c$ o termo $e^{-ct}$ já se foi e $V$ acompanha as células infectadas com inclinação $-\delta$ ; para $t \ll 1/\delta$ e $c \gg \delta$ a inclinação inicial é $-c$ . ∎

Exemplo 13.6 (O HIV antes e depois das equações)

Até 1995 os anos de latência clínica da infecção por HIV — uma carga viral estável de $10^{4}$ a $10^{6}$ cópias por mililitro e uma queda lenta dos linfócitos T — eram lidos como um vírus quiescente. Ho, Perelson e colaboradores deram a pacientes um inibidor de protease e ajustaram a queda da carga viral ao teorema: a fase rápida deu $c \approx 3\,\mathrm{d}^{-1}$ (meia-vida do vírion de cerca de seis horas) e a fase lenta, $\delta \approx 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ (uma célula infectada vive cerca de um dia e meio). Uma carga estável de $10^{5}$ por mililitro em $15\,\mathrm{L}$ de líquido corporal, depurada a $c$ , portanto exige a produção de cerca de $10^{10}$ vírions por dia, todo dia, por anos: o período “latente” é um estado estacionário furioso de infecção e morte, com o conjunto de linfócitos T sendo substituído diariamente até falhar. A aritmética de mutação da seção seguinte se segue de imediato, e com ela a razão pela qual fármacos isolados falharam e três não falharam.

Carga viral depois que um fármaco interrompe as novas infecções, pelo teorema com c = 3\, d-1 e = 0.5\, d-1: uma queda rápida enquanto os vírions livres são depurados, e depois uma queda mais lenta, no ritmo da morte das células já infectadas. — Carga viral depois que um fármaco interrompe as novas infecções, pelo teorema com $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ e $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ : uma queda rápida enquanto os vírions livres são depurados, e depois uma queda mais lenta, no ritmo da morte das células já infectadas.

13.3 Como os vírus evoluem

Definição 13.7 (Mutação, quase-espécie, deriva e salto)

As polimerases dependentes de RNA e as transcriptases reversas não fazem revisão, e os vírus de RNA mutam a $10^{-4}$ – $10^{-6}$ por nucleotídeo por replicação — de mil a um milhão de vezes a taxa de seus hospedeiros —, de modo que a população de um vírus de RNA é uma nuvem de genomas aparentados, uma quase-espécie, na qual cada mutante pontual está presente o tempo todo, se a população for grande. A seleção pelos anticorpos impulsiona a deriva antigênica: as proteínas de superfície da influenza acumulam substituições ano a ano, e a imunidade do ano passado protege menos a cada temporada. O salto antigênico é um pulo: um genoma segmentado (a influenza tem oito segmentos de RNA) pode sofrer rearranjo de segmentos quando duas linhagens infectam uma mesma célula, e um segmento que codifica uma hemaglutinina de um vírus de ave ou de porco, à qual nenhum humano tem imunidade, produz uma pandemia — 1918, 1957, 1968, 2009. A recombinação dentro de um genoma faz o mesmo para os vírus não segmentados, e os coronavírus recombinam à vontade. A maioria dos vírus humanos novos são zoonoses, que cruzam de um reservatório animal — morcegos para os coronavírus, o Ebola e a raiva; aves e porcos para a influenza; primatas para o HIV —, e o cruzamento é em geral uma questão de poucas mutações numa proteína de ligação a receptor.

Proposição 13.8 (O limiar de erro)

Um genoma de $L$ nucleotídeos copiado com taxa de erro $u$ por nucleotídeo é copiado sem erro algum com probabilidade $(1-u)^{L} \approx e^{-uL}$ . Se a sequência mais apta tem de persistir na população contra a enxurrada de seus mutantes, a fração de cópias sem erro precisa exceder mais ou menos o inverso de sua vantagem seletiva $\sigma$ : $e^{-uL} \gtrsim 1/\sigma$ , isto é, $uL \lesssim \ln\sigma$ , um número da ordem de um. O produto da taxa de mutação pelo comprimento do genoma é, portanto, limitado: um vírus de RNA com $u = 10^{-4}$ não pode ter um genoma muito mais longo que $10^{4}$ nucleotídeos, que é mais ou menos o que os vírus de RNA têm, e os coronavírus, com $30\,\mathrm{kb}$ os genomas de RNA mais longos conhecidos, só o conseguem por codificarem uma exonuclease de revisão que corta $u$ em dez vezes. O limiar é também uma arma: fármacos que elevam a taxa de erro da polimerase (ribavirina, molnupiravir) empurram um vírus para além dele, à catástrofe de erro, e a quase-espécie desmorona.

Demonstração. Erros independentes em cada um dos $L$ sítios dão a probabilidade de ausência de erro $(1-u)^{L}$ , e $\ln(1-u) \approx -u$ para $u$ pequeno. O balanço populacional é o argumento padrão de quase-espécie (Eigen, 1971): a sequência mestra é reposta à taxa $\sigma e^{-uL}$ em relação ao mutante médio e é perdida por mutação no restante; ela só se mantém se a primeira exceder $1$ , de onde vem o limite. ∎

Dois modos de um vírus da influenza escapar da imunidade. Deriva: as mutações nas espículas se acumulam aos poucos. Salto: duas linhagens numa mesma célula trocam segmentos inteiros de genoma, e uma proteína de espícula nova para os humanos aparece de uma vez.

Exemplo 13.9 (Por que o HIV precisou de três fármacos)

A transcriptase reversa do HIV erra cerca de uma vez em $10^{5}$ nucleotídeos, de modo que cada genoma de $9700\,\mathrm{nt}$ copiado carrega cerca de $0.1$ mutação, e $10^{10}$ genomas novos por dia carregam $10^{9}$ mutações entre si: cada uma das $3\times 9700 \approx 30\,000$ mutações pontuais possíveis surge muitas vezes todo dia, antes que qualquer fármaco seja dado. Um fármaco que uma única mutação derrota — como uma mutação derrota a maioria dos inibidores de transcriptase reversa e de protease — é, portanto, derrotado em semanas, que foi o que aconteceu com a AZT em 1987. Duas mutações independentes surgem juntas a $10^{-10}$ por genoma, cerca de uma vez por dia; três a $10^{-15}$ , uma vez a cada mil dias — e um paciente com três fármacos cuja carga caiu mil vezes produz $10^{7}$ genomas por dia, de modo que o mutante triplo nunca aparece. Isso, e a demonstração do teorema de que o vírus se replicava a toda velocidade, fizeram da terapia combinada, a partir de 1996, o tratamento que converteu a aids numa condição crônica.

13.4 Hospedeiros, defesas e fármacos

Proposição 13.10 (Patogênese e defesa)

Um vírus causa dano lisando células (o poliovírus destrói neurônios motores, o HIV mata linfócitos T), fazendo as células produzirem produtos tóxicos, transformando-as (Capítulo 11) e, muitas vezes, sobretudo pela própria resposta do hospedeiro: a febre, o dano tecidual e, no pior caso, a tempestade de citocinas da reação imune à influenza ou aos coronavírus da SARS. O hospedeiro responde com defesas inatas que reconhecem as assinaturas da replicação viral — RNA de fita dupla, RNA sem capuz, DNA no citosol — e reagem com interferon, que põe cada célula vizinha num estado antiviral (Capítulo 15); com células matadoras naturais que destroem células que esconderam seu MHC; com anticorpos que neutralizam vírions e linfócitos T citotóxicos que matam células infectadas antes que elas liberem a prole (Capítulo 16); e, nas bactérias, com enzimas de restrição que cortam DNA estranho e com a memória CRISPR do Capítulo 6. Os vírus respondem por sua vez: quase todo vírus grande codifica proteínas que bloqueiam o interferon, escondem o MHC, imitam citocinas ou inibem a apoptose, e a corrida armamentista está escrita nos dois genomas.

Definição 13.11 (Antivirais e vacinas)

Os antivirais atacam as enzimas virais ou as etapas que uma célula hospedeira não realiza. Os análogos de nucleosídeo são terminadores de cadeia: o aciclovir só é fosforilado pela timidina-cinase do herpesvírus e então bloqueia a DNA-polimerase viral, de modo que age apenas em células infectadas; a AZT, o tenofovir e a lamivudina detêm a transcriptase reversa; o remdesivir e o molnupiravir agem sobre a polimerase do coronavírus, o segundo por mutagênese. Os inibidores de protease bloqueiam a clivagem das poliproteínas virais (HIV, hepatite C, o nirmatrelvir do SARS-CoV-2). Os inibidores de integrase impedem a formação do provírus do HIV; os inibidores de neuraminidase impedem que os vírions da influenza se soltem da célula de que brotam; os inibidores de entrada bloqueiam um receptor. O vírus da hepatite C é hoje curado em doze semanas por combinações de fármacos de ação direta, a primeira infecção viral crônica já curada por quimioterapia. As vacinas apresentam os antígenos do vírus sem sua doença: um vírus vivo atenuado (sarampo, poliomielite por via oral, febre amarela), um vírus inativado (poliomielite injetável, influenza), uma subunidade (o antígeno de superfície da hepatite B feito em levedura, a proteína do capsídeo do papilomavírus), um vetor viral inofensivo que carrega um gene do alvo, ou, desde 2020, RNA mensageiro que codifica o antígeno, entregue em nanopartículas lipídicas, e que as próprias células de quem o recebe traduzem. A imunologia de por que elas funcionam, e de quantas pessoas precisam ser vacinadas para proteger as demais, é assunto do Capítulo 16.

Observação 13.12 (Os vírus na economia da vida)

Os vírus que fazem mal aos humanos são um erro de arredondamento na população de vírus do mundo, que em sua maioria infecta bactérias e arqueias. Os fagos matam de um quinto a um terço das bactérias do oceano por dia e devolvem seu conteúdo ao meio dissolvido — o desvio viral do ciclo do carbono do volume do 2.º ano. Eles movem genes entre bactérias (Capítulo 12), e suas toxinas são as toxinas da difteria, do cólera e da pior E. coli. Oito por cento do genoma humano são os restos de retrovírus antigos (Capítulo 4), e um dos genes de envelope deles hoje funde as células da placenta. Os vírus são o maior reservatório de novidade genética do planeta, e a fronteira do que conta como vivo passa por eles.

13.5 Exercícios

Exercício 13.1 ★

Situe o poliovírus, a influenza, o HIV, o herpes simples, a hepatite B e o rotavírus em suas classes de Baltimore e diga que enzima cada um precisa trazer ou fazer e que a célula não tem.

Solução

Solução de Exercício 13.1.

Poliovírus: IV, RNA de fita positiva — uma RNA-polimerase dependente de RNA. Influenza: V, RNA de fita negativa — sua própria RNA-polimerase, carregada no vírion. HIV: VI — transcriptase reversa (e integrase). Herpes simples: I, DNA de fita dupla — o hospedeiro poderia em princípio fornecer tudo, mas ele traz sua própria DNA-polimerase e uma timidina-cinase. Hepatite B: VII — uma transcriptase reversa para copiar seu RNA pré-genômico em DNA. Rotavírus: III, RNA de fita dupla — uma RNA-polimerase dependente de RNA dentro da partícula.

Exercício 13.2 ★

O que o experimento de Hershey–Chase mostrou, e o que se teria encontrado se a proteína carregasse as instruções?

Solução

Solução de Exercício 13.2.

O DNA do fago ( $^{32}$ P) entrou nas bactérias e a proteína ( $^{35}$ S) ficou do lado de fora e pôde ser arrancada; a prole do fago herdou o $^{32}$ P. Logo, o DNA é o que o fago injeta e o que dirige a produção de fagos novos. Se a proteína carregasse as instruções, o $^{35}$ S teria sido encontrado dentro e passado à prole.

Exercício 13.3 ★

Um estoque de fago diluído $10^{-7}$ dá $84$ placas a partir de $0.1\,\mathrm{mL}$ . Qual é o título? Por que o microscópio eletrônico pode contar dez vezes mais partículas?

Solução

Solução de Exercício 13.3.

$84/(0.1\times 10^{-7}) = 8.4\times 10^{9}$ unidades formadoras de placa por mL. O microscópio conta cada partícula, inclusive capsídeos vazios, partículas de genoma defeituoso e as que não conseguem aderir ou injetar; só as partículas que completam uma infecção formam placas.

Exercício 13.4 ★

Liste as seis etapas de um ciclo de replicação e, para cada uma, nomeie um antiviral ou uma defesa do hospedeiro que age sobre ela.

Solução

Solução de Exercício 13.4.

Adesão: inibidores de entrada (maraviroque), anticorpos neutralizantes. Entrada/fusão: inibidores de fusão, bloqueadores da acidificação endossomal. Desnudamento: fármacos que se ligam ao capsídeo (pleconaril; lenacapavir). Expressão e replicação: análogos de nucleosídeo, inibidores de transcriptase reversa e de integrase, interferon, interferência por RNA. Montagem: inibidores de protease (poliproteínas não clivadas não se montam). Liberação: inibidores de neuraminidase (influenza), e linfócitos T citotóxicos que matam a célula antes da liberação.

Exercício 13.5 ★★

Usando a Proposição 13.2, calcule o ácido nucleico necessário para codificar o capsídeo de um vírus feito de $180$ cópias de uma proteína de $30\,\mathrm{kDa}$ , e compare com o genoma de $4.5\,\mathrm{kb}$ que tal vírus poderia ter. Que fração do genoma é o gene do capsídeo?

Solução

Solução de Exercício 13.5.

Uma proteína de $30\,\mathrm{kDa}$ tem $30\,000/110 = 273$ resíduos, $818$ nucleotídeos: $0.82\,\mathrm{kb}$ , $18\,\%$ de um genoma de $4.5\,\mathrm{kb}$ . Codificar as $180$ cópias separadamente exigiria $147\,\mathrm{kb}$ , trinta e três vezes o genoma inteiro; a própria proteína do capsídeo ( $5.4\,\mathrm{MDa}$ ) pesa quatro vezes mais que o genoma ( $1.5\,\mathrm{MDa}$ ).

Exercício 13.6 ★★

Com $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ , $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ e $V_{0} = 10^{5}$ por mL, calcule $V$ pelo teorema em $t = 0.5$ , $2$ e $10$ dias. Quanto tempo até a carga cair abaixo de $50$ por mL, o limite de detecção?

Solução

Solução de Exercício 13.6.

$V = 10^{5}(3e^{-0.5t} - 0.5e^{-3t})/2.5$ : $t = 0.5$ : $8.9\times 10^{4}$ ; $t = 2$ : $4.4\times 10^{4}$ ; $t = 10$ : $8\times 10^{2}$ . Abaixo de $50$ quando $1.2\times 10^{5}e^{-0.5t} = 50$ : $t = 2\ln(2400) \approx 16\,\mathrm{d}$ .

Exercício 13.7 ★★

Um vírus de RNA tem $u = 3\times 10^{-5}$ e $L = 12\,\mathrm{kb}$ . Que fração dos genomas de sua prole não carrega mutação alguma? O que acontece com essa fração se um fármaco mutagênico triplicar $u$ ? Explique por que os coronavírus precisaram de uma enzima de revisão.

Solução

Solução de Exercício 13.7.

$uL = 0.36$ ; fração sem erro $e^{-0.36} = 0.70$ . Com o triplo: $uL = 1.08$ , $e^{-1.08} = 0.34$ — a maioria da prole passa a carregar mutações e a sequência mais apta é diluída rumo ao limiar. Um coronavírus de $30\,\mathrm{kb}$ com $u = 10^{-4}$ teria $uL = 3$ e apenas $5\,\%$ de cópias sem erro, além do limiar; sua exonuclease leva $u$ a $10^{-5}$ , $uL = 0.3$ , e três quartos ficam sem erro.

Exercício 13.8 ★★

Explique a deriva e o salto antigênicos na influenza, e por que uma linhagem pandêmica sempre carregou, até agora, uma hemaglutinina nova.

Solução

Solução de Exercício 13.8.

Deriva: as mutações pontuais na hemaglutinina e na neuraminidase se acumulam sob a seleção dos anticorpos, de modo que a linhagem de cada temporada é em parte nova e a imunidade do ano passado fica em parte obsoleta. Salto: a coinfecção de uma mesma célula por uma linhagem humana e uma animal rearranja os oito segmentos, e um subtipo de hemaglutinina de aves ou de porcos aparece num vírus adaptado aos humanos. Ninguém tem anticorpos contra o subtipo novo, de modo que a população inteira fica suscetível de uma vez — a condição para uma pandemia, cumprida em 1918, 1957, 1968 e 2009, a cada vez com uma hemaglutinina nova.

Exercício 13.9 ★★

O aciclovir é um análogo de guanosina que precisa ser fosforilado para agir. Explique por que ele faz mal a células infectadas por herpes e não às demais, e preveja as mutações de resistência.

Solução

Solução de Exercício 13.9.

A timidina-cinase do herpesvírus fosforila o aciclovir, no qual as cinases celulares mal tocam; as cinases celulares então completam o trifosfato, que a DNA-polimerase viral incorpora e que, sem hidroxila 3 $'$ , termina a cadeia. As células não infectadas nunca fazem a forma ativa, e a polimerase viral a prefere à celular. Resistência: perda ou alteração da timidina-cinase viral (a mais comum), ou mutações na polimerase viral que excluam o análogo.

Exercício 13.10 ★★★

Deduza $R_{0} = \beta Tp/(c\delta)$ das duas equações do teorema encontrando a condição para que uma infecção pequena ( $I$ e $V$ perto de zero, $T$ constante) cresça, e interprete cada fator.

Solução

Solução de Exercício 13.10.

Com $T$ constante, as equações são lineares em $(I, V)$ com matriz $\begin{pmatrix} -\delta & \beta T \\ p & -c \end{pmatrix}$ , traço $-(\delta + c) < 0$ e determinante $\delta c - \beta Tp$ . Os autovalores têm traço negativo, de modo que um deles é positivo exatamente quando o determinante é negativo: $\beta Tp > c\delta$ , isto é, $R_{0} = \beta Tp/(c\delta) > 1$ . Fatores: $p/\delta$ é o número de vírions que uma célula infectada faz em sua vida; $\beta T/c$ é o número de células que um vírion infecta em sua vida; o produto é o número de células infectadas que uma célula infectada produz.

Exercício 13.11 ★★★

Um paciente em terapia eficaz ainda abriga $10^{6}$ linfócitos T em repouso infectados latentemente, cujo provírus está silencioso, com meia-vida de $44$ meses. Por quanto tempo a terapia teria de continuar para o reservatório cair abaixo de uma célula? Por que isso torna o HIV incurável por fármacos que bloqueiam a replicação, e o que uma cura exigiria?

Solução

Solução de Exercício 13.11.

$10^{6} = 2^{20}$ : vinte meias-vidas, $880$ meses, cerca de $73$ anos — mais que uma vida. Os fármacos que bloqueiam a replicação não tocam num provírus que não está sendo transcrito; o reservatório persiste e, quando a terapia para, uma única célula que reative reinicia a infecção. Uma cura precisa remover ou silenciar permanentemente o reservatório: matar as células latentes (reativá-las sob terapia para que morram ou sejam mortas), excisar ou inutilizar o provírus, ou substituir o sistema imune por um que o vírus não consiga infectar.

Exercício 13.12 ★★★

Explique o argumento do Exemplo 13.9 com seus próprios números para um vírus de $30\,\mathrm{kb}$ com $u = 10^{-6}$ que produza $10^{9}$ genomas por dia. Quantos fármacos você combinaria, e por que fármacos contra dois sítios de uma mesma enzima poderiam não contar como dois?

Solução

Solução de Exercício 13.12.

$uL = 0.03$ mutação por genoma; $10^{9}$ genomas por dia carregam $3\times 10^{7}$ mutações entre $9\times 10^{4}$ mutações únicas possíveis: cada uma surge cerca de $300$ vezes por dia. Um mutante duplo específico surge a $10^{-12}$ por genoma, $10^{-3}$ por dia — uma vez a cada três anos; um triplo a $10^{-18}$ , nunca. Dois fármacos com mutações de resistência independentes bastariam em princípio, e três dão margem para adesão imperfeita. Dois fármacos que se ligam à mesma enzima podem ser derrotados por uma única mutação que altere o sítio ou a conformação da enzima, e suas mutações de resistência não são independentes; eles contam como menos de dois.

13.6 Problema: um vírus num paciente

Problema 13.1

Problema de fim de semana — uma infecção por HIV contada vírion a vírion, sua dinâmica ajustada a uma curva de tratamento, suas mutações somadas contra os fármacos e seu reservatório cronometrado, terminando na produção diária de vírions, no dia em que a carga fica indetectável e na probabilidade de existir um mutante triplo

Dados: carga viral $V^{*} = 2\times 10^{5}$ por mL em $15\,\mathrm{L}$ de líquido corporal; $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ , $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ ; cada célula infectada faz $p = 500$ vírions por dia; genoma $9700\,\mathrm{nt}$ , $u = 10^{-5}$ por nucleotídeo por replicação; mutações únicas conferem resistência a cada um de três fármacos; em terapia tripla a produção cai a $10^{7}$ genomas por dia; reservatório latente $10^{6}$ células, meia-vida $44$ meses; um vírion é uma esfera de $120\,\mathrm{nm}$ que contém duas fitas de RNA de $9700\,\mathrm{nt}$ e cerca de $2000$ moléculas de proteína de $25\,\mathrm{kDa}$ .

Parte I — Contagem.

Quantos vírions há no corpo no estado estacionário?
Quantos são depurados por dia e, portanto, produzidos por dia?
Quantas células infectadas os produzem, e quantas morrem por dia?
Qual é a massa de um vírion (RNA a $330\,\mathrm{Da}$ por nucleotídeo mais a proteína), e a massa total de vírions no corpo? Compare com um grão de areia ( $1\,\mathrm{mg}$ ).
O corpo tem $10^{12}$ linfócitos T CD4 e repõe os infectados. Que fração do conjunto está infectada a cada momento, e como uma fração tão pequena mata o conjunto em dez anos?
Se cada célula infectada morre por apoptose e é englobada em menos de uma hora (Capítulo 10), quantas estão sendo removidas a cada momento?

Parte II — O tratamento.

A terapia interrompe as novas infecções em $t = 0$ . Calcule $V$ em $t = 1$ , $3$ , $7$ e $14$ dias pelo teorema.
Em que dia a carga cai abaixo do limite de detecção de $50$ por mL?
A partir das duas inclinações, como um clínico estimaria $c$ e $\delta$ com medidas dos dias $0$ – $1$ e $3$ – $10$ ?
Depois das duas fases a carga se achata em algumas cópias por mL e fica assim por anos. Que compartimento do modelo está faltando, e qual é sua taxa de decaimento?
Calcule a meia-vida de um vírion livre e a de uma célula infectada.
Explique por que o platô pré-tratamento foi lido como latência, e o que as equações mostraram em vez disso.

Parte III — Mutação.

Mutações por genoma por replicação, e mutações produzidas por dia no paciente sem tratamento.
Quantas mutações pontuais distintas são possíveis no genoma? Quantas vezes por dia cada uma surge?
Taxa por genoma de um mutante duplo específico e de um mutante triplo específico; quantos de cada surgem por dia sem tratamento?
Em terapia tripla, com $10^{7}$ genomas por dia, quantos mutantes triplos se esperam por ano?
O paciente esquece doses, de modo que o nível de um dos fármacos cai a zero por uma semana enquanto os outros dois se mantêm. Que mutantes podem agora ser selecionados, e qual é o número esperado dos mutantes duplos relevantes produzidos naquela semana a $10^{7}$ genomas por dia?
Por que a resistência a um análogo de nucleosídeo muitas vezes confere resistência a outro, e como isso muda a contagem de fármacos “independentes”?

Parte IV — O reservatório e a cura.

Com meia-vida de $44$ meses, quanto tempo para as $10^{6}$ células latentes caírem a uma? E a $10^{4}$ ?
Se a terapia for interrompida, basta uma célula latente reativar para reiniciar a infecção. Quanto tempo depois da interrupção a carga volta a $10^{5}$ por mL, se ela cresce com $R_{0} = 8$ por geração de $2$ dias a partir de um vírion?
Proponha duas estratégias de cura que decorram do modelo, e enuncie o obstáculo de cada uma.
O $R_{0}$ do teorema é dentro de um hospedeiro. Um $R_{0}$ populacional do HIV entre pessoas é de cerca de $3$ a $5$ . Que fração das transmissões precisa ser impedida para encerrar a epidemia ( $1 - 1/R_{0}$ )?
O tratamento reduz a transmissibilidade de um paciente essencialmente a zero. Explique como o “tratamento como prevenção” decorre do teorema dentro do hospedeiro.
Uma vacina de eficácia $E$ (a fração das pessoas vacinadas que ficam protegidas) dada a uma fração $f$ da população protege $Ef$ dela. Que cobertura $f$ é necessária para alcançar o limiar da questão anterior com $E = 0.7$ ? E com $E = 0.9$ ? O que a primeira resposta significa?
Resuma: os vírions produzidos por dia (questão 2), o dia em que a carga fica indetectável (questão 8) e o número esperado de mutantes triplos por ano em terapia (questão 16).

Solução

Solução de Problema 13.1.

1. $2\times 10^{5}\times 1.5\times 10^{4} = 3\times 10^{9}$ vírions. 2. Depurados $cV = 3\times 3\times 10^{9} \approx 10^{10}$ por dia; produzidos, os mesmos. 3. $I^{*} = cV^{*}/p = 9\times 10^{9}/500 = 1.8\times 10^{7}$ células infectadas; morrendo $\delta I^{*} = 9\times 10^{6}$ por dia. 4. RNA $2\times 9700\times 330 = 6.4\times 10^{6}$ Da; proteína $2000\times 25\,000 = 5\times 10^{7}$ Da; total $5.6\times 10^{7}$ Da $\approx 10^{-16}$ g. Todos os vírions juntos: $3\times 10^{9}\times 10^{-16} = 3\times 10^{-7}$ g, um terço de micrograma — três mil vezes menos que um grão de areia. 5. $1.8\times 10^{7}/10^{12} = 2\times 10^{-5}$ do conjunto. Dez anos de $9\times 10^{6}$ mortes por dia dão $3\times 10^{10}$ células, três por cento do conjunto: o conjunto falha não por subtração aritmética, mas porque uma década de regeneração forçada e de ativação crônica esgota a capacidade de repô-las. 6. $9\times 10^{6}/24 \approx 4\times 10^{5}$ corpos sendo removidos a cada momento. 7. $V = 2\times 10^{5}(3e^{-0.5t} - 0.5e^{-3t})/2.5$ : $t = 1$ : $1.4\times 10^{5}$ ; $t = 3$ : $5.4\times 10^{4}$ ; $t = 7$ : $7\times 10^{3}$ ; $t = 14$ : $2\times 10^{2}$ . 8. $2.4\times 10^{5}e^{-0.5t} = 50$ : $t = 2\ln(4800) \approx 17$ dias. 9. Os dias 3–10 caem na fase lenta: a inclinação de $\ln V$ ali é $-\delta$ (de $5.4\times 10^{4}$ a $1.6\times 10^{3}$ em sete dias, $\delta = 0.50$ ). A fase rápida dura apenas horas ( $1/c$ ), de modo que $c$ exige amostras de poucas em poucas horas no primeiro dia, ajustadas à fórmula de duas exponenciais. 10. As células infectadas latentes, que liberam vírus à medida que reativam; sua taxa de decaimento é $\ln 2/44$ por mês, cerca de $5\times 10^{-4}$ por dia. 11. Vírion $\ln 2/3 = 0.23\,\mathrm{d}$ , cerca de $5.5\,\mathrm{h}$ ; célula infectada $\ln 2/0.5 = 1.4\,\mathrm{d}$ . 12. Uma carga constante parecia um vírus que não fazia nada; as equações a mostram como um estado estacionário em que $10^{10}$ vírions são feitos e depurados e $10^{7}$ linfócitos T infectados e mortos todo dia. 13. $9700\times 10^{-5} \approx 0.1$ mutação por genoma; $10^{10}\times 0.1 = 10^{9}$ mutações por dia. 14. $3\times 9700 \approx 29\,000$ mutações únicas possíveis; cada uma surge $10^{9}/29\,000 \approx 3\times 10^{4}$ vezes por dia. 15. Duplo específico: $10^{-10}$ por genoma, cerca de um por dia sem tratamento; triplo específico: $10^{-15}$ , $10^{-5}$ por dia — uma vez a cada três séculos. 16. $10^{7}\times 10^{-15} = 10^{-8}$ por dia, $4\times 10^{-6}$ por ano. 17. Sem um dos fármacos, bastam mutantes resistentes aos outros dois: um duplo específico a $10^{-10}$ ; $7\times 10^{7}$ genomas na semana dão $7\times 10^{-3}$ esperados — ainda improvável, a menos que a carga suba de volta rumo a $10^{10}$ por dia durante o lapso, quando isso passa a ser um por dia e o escape fica provável. As doses esquecidas são o modo como a resistência chega. 18. Os análogos compartilham o sítio ativo da transcriptase reversa, e uma única mutação ali (ou um conjunto de mutações de análogo de timidina) altera o modo como a enzima lida com vários deles: a resistência cruzada. Dois nucleosídeos contam como menos de dois fármacos independentes, e por isso os esquemas combinam classes — um nucleosídeo, um inibidor de integrase, um inibidor de protease ou um não nucleosídeo. 19. $20$ meias-vidas, $880$ meses, $73$ anos; até $10^{4}$ , $\log_{2}100 = 6.6$ meias-vidas, $290$ meses, $24$ anos. 20. De um vírion a $3\times 10^{9}$ com $R_{0} = 8$ por geração: $\ln(3\times 10^{9})/\ln 8 = 10.5$ gerações, três semanas. 21. Choque e morte: reativar as células latentes sob terapia para que morram ou sejam mortas — obstáculo: nenhum agente reativa todas elas, e as células reativadas não são mortas de modo confiável. Edição gênica: excisar o provírus ou destruir o receptor CCR5 nas células do paciente — obstáculo: chegar a cada célula. (Substituir a medula por células de doador sem CCR5 curou um punhado de pacientes, a um risco aceitável apenas quando o transplante já era necessário de qualquer modo.) 22. $1 - 1/R_{0}$ : $67\,\%$ para $R_{0} = 3$ e $80\,\%$ para $5$ . 23. A terapia faz $\beta \to 0$ dentro do paciente, a carga cai pelo teorema a quase nada, e a transmissão, que é proporcional à carga, cessa; tratar cada pessoa infectada leva o $R_{0}$ da população abaixo de um. 24. $f = (1 - 1/R_{0})/E$ : com $R_{0} = 4$ e $E = 0.7$ , $f = 0.75/0.7 = 1.07$ — mais que todo mundo: a vacina sozinha não consegue alcançar o limiar; com $E = 0.9$ , $f = 0.83$ . 25. Cerca de $10^{10}$ vírions produzidos por dia; indetectável por volta do dia $17$ ; uns $4\times 10^{-6}$ mutantes triplos por ano em terapia.

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