Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

10Controle do ciclo celular e morte celular programada

Cerca de cem bilhões de células do seu corpo vão morrer hoje, de propósito, e cem bilhões vão nascer para substituí-las; o revestimento do seu intestino é renovado a cada cinco dias, e suas hemácias a cada quatro meses. Um girino perde a cauda sem sangrar; a membrana entre os dedos de um embrião humano some na oitava semana; metade dos neurônios já produzidos num cérebro é morta antes do nascimento. Cada uma dessas mortes é executada pela própria célula, segundo um programa, e cada um dos nascimentos é autorizado por um sistema de controle que decide, em dois ou três pontos do ciclo, se a célula pode prosseguir. Os dois programas — divisão e suicídio — são o assunto deste capítulo. Eles foram elucidados em leveduras, óvulos de rã, ouriços-do-mar e um verme com exatamente $1090$ células somáticas, das quais exatamente $131$ morrem, e revelaram-se os mesmos nos humanos, onde suas falhas são o câncer de um lado e a degeneração do outro.

10.1 O motor do ciclo

Definição 10.1 (Ciclinas e cinases dependentes de ciclina)

O ciclo celular — G1, S (replicação), G2, M (mitose) — é impulsionado por uma família de cinases proteicas, as cinases dependentes de ciclina (CDKs), cujas subunidades catalíticas estão presentes ao longo de todo o ciclo, mas só ficam ativas quando ligadas a uma ciclina, uma subunidade regulatória cuja concentração sobe e desce numa ordem fixa: a ciclina D com a Cdk4/6 em G1 em resposta a fatores de crescimento, a ciclina E com a Cdk2 na transição G1/S, a ciclina A com a Cdk2 ao longo de S, a ciclina B com a Cdk1 na entrada em mitose. Cada par ciclina–CDK fosforila as proteínas de sua fase — origens de replicação, lâminas, condensinas, as enzimas da montagem do fuso — e cada um é desligado pela destruição de sua ciclina: ubiquitina-ligases (o SCF em G1/S, o complexo promotor da anáfase, APC/C, na mitose) marcam as ciclinas para o proteassomo. A atividade da Cdk1 ainda é controlada por uma fosforilação inibitória posta pela cinase Wee1 e removida pela fosfatase Cdc25, e por pequenas proteínas inibidoras (p21, p27, p16) que se ligam aos complexos. O ciclo é, assim, uma sequência ordenada de ondas de cinase, cada onda terminando na proteólise daquilo que a produziu.

Evidência. Três linhas convergiram. Hartwell (anos 1970) isolou mutantes cdc sensíveis à temperatura da levedura de brotamento, cada um parado numa etapa com um tamanho de broto característico, e definiu o Start, o ponto em G1 depois do qual uma célula está comprometida com um ciclo. Nurse (anos 1980) descobriu, na levedura de fissão, que o cdc2 controlava o instante da mitose e que o gene humano, posto na levedura, resgatava o mutante: a cinase era a Cdk1, conservada da levedura ao homem. Hunt (1983) encontrou, em óvulos de ouriço-do-mar, uma proteína que se acumulava a cada ciclo e era destruída de repente a cada divisão, e a chamou de ciclina. O óvulo de rã havia, entretanto, fornecido um “fator promotor da maturação” que levava qualquer núcleo à mitose; ele era a ciclina B ligada à Cdk1. Rao e Johnson (1970) haviam mostrado, fundindo células, que uma célula em fase S leva um núcleo em G1 à replicação, ao passo que um núcleo em G2 espera — o citoplasma carrega o sinal, e um núcleo já replicado não pode ser levado a replicar de novo. ∎

O ciclo como uma sequência de ondas de ciclina–CDK, cada uma encerrada pela destruição de sua ciclina, com os três pontos de checagem (barras vermelhas) em que a célula pergunta se deve prosseguir.

Teorema 10.2 (Um interruptor e um freio atrasado fazem um oscilador)

Seja $A$ a atividade da ciclina B–Cdk1 e $C$ a quantidade de ciclina B. Suponha que (i) para um $C$ fixo, $A$ relaxa depressa a um estado estacionário que depende de $C$ por uma retroalimentação positiva (a Cdk1 ativa estimula seu ativador Cdc25 e inibe seu inibidor Wee1), de modo que a curva de estado estacionário $A^{*}(C)$ tem forma de S: para $C$ entre dois limiares $C_{1} < C_{2}$ existem tanto um estado baixo quanto um alto, e o sistema permanece no ramo em que estiver (a histerese); (ii) $C$ muda devagar, sendo sintetizada a uma taxa constante $k_{s}$ e degradada a uma taxa $k_{d}A\,C$ pelo APC/C, que a Cdk1 ativa liga depois de um atraso. Então o sistema não tem estado estacionário estável e executa uma oscilação de relaxação: $C$ se acumula no ramo baixo até ultrapassar $C_{2}$ , $A$ salta para o ramo alto (entrada em mitose), a degradação supera a síntese e $C$ cai até passar por $C_{1}$ , $A$ desaba para o ramo baixo (saída da mitose), e o ciclo se repete. O período é fixado sobretudo pela variável lenta: cerca de $C_{2}/k_{s}$ para a subida, mais o tempo de degradar de $C_{2}$ a $C_{1}$ .

Prova parcial. Um estado estacionário do par exigiria $\mathrm{d}C/\mathrm{d}t = 0$ , isto é, $k_{s} = k_{d}A^{*}(C)\,C$ , num ponto da curva em S. No ramo baixo $A^{*}$ é pequeno, de modo que $k_{d}A^{*}C < k_{s}$ para $C$ até $C_{2}$ : a ciclina sobe, e o sistema é levado para fora da ponta do ramo. No ramo alto $A^{*}$ é grande, de modo que $k_{d}A^{*}C > k_{s}$ para $C$ até $C_{1}$ : a ciclina cai, e o sistema é levado para fora daquela ponta. O único candidato a estado estacionário ficaria no ramo intermediário, instável, e um ponto ali repele; logo não há estado estacionário estável, e a trajetória, confinada aos dois ramos estáveis e aos saltos entre eles, percorre um ciclo. O tempo no ramo baixo é $\int \mathrm{d}C/(k_{s} - k_{d}A^{*}C) \approx C_{2}/k_{s}$ quando $A^{*}$ é pequeno, e o tempo no ramo alto é o tempo mais curto de degradar $C_{2} - C_{1}$ à taxa $k_{d}A^{*}_{\text{alto}}C$ . A existência da curva em S a partir da retroalimentação Cdc25/Wee1 é admitida aqui; é a mesma biestabilidade do gene autoativador do volume do 2.º ano, com a variável rápida sendo agora uma cinase e a lenta, sua ciclina. ∎

À esquerda: o plano de fase do oscilador. A curva em S é o estado estacionário rápido da Cdk1 para cada nível de ciclina; o laço vermelho é o ciclo — acumulação lenta ao longo do ramo baixo, um salto em C_2, degradação rápida ao longo do ramo alto, um salto de volta em C_1. À direita: a evolução temporal resultante, um dente de serra de ciclina e uma onda quadrada de cinase. — À esquerda: o plano de fase do oscilador. A curva em S é o estado estacionário rápido da Cdk1 para cada nível de ciclina; o laço vermelho é o ciclo — acumulação lenta ao longo do ramo baixo, um salto em $C_{2}$ , degradação rápida ao longo do ramo alto, um salto de volta em $C_{1}$ . À direita: a evolução temporal resultante, um dente de serra de ciclina e uma onda quadrada de cinase.

Exemplo 10.3 (Por que o óvulo de rã é um relógio)

Um óvulo de rã fecundado se divide doze vezes em seis horas, sem crescimento, sem transcrição e sem pontos de checagem, a intervalos de $30\,\mathrm{min}$ : é o oscilador do teorema funcionando nu, e um extrato de seu citoplasma num tubo de ensaio continua a ciclar, com a ciclina subindo e descendo, sem nada a dividir. Acrescentar uma ciclina B não degradável trava o extrato em mitose, já que $C$ nunca pode cair abaixo de $C_{1}$ ; bloquear a síntese de ciclina o trava em interfase. Numa célula somática o mesmo motor vem embrulhado nos controles da seção seguinte, que o seguram nos limiares até que as condições sejam cumpridas, de modo que o período passa a ser um dia em vez de meia hora, e pode ser indefinidamente longo.

10.2 Pontos de checagem

Definição 10.4 (Pontos de checagem)

Um ponto de checagem é um controle que detém o ciclo numa transição até que uma condição seja satisfeita, agindo sobre o motor — inibindo uma CDK ou uma ubiquitina-ligase. Três importam mais. O ponto de restrição no fim de G1 (o Start na levedura): a célula só prossegue se fatores de crescimento, nutrientes e tamanho o permitirem; passado ele, o ciclo se completa sem eles. O ponto de checagem G2/M: DNA danificado ou não replicado, sinalizado pelas cinases ATM/ATR do Capítulo 3, mantém a Cdc25 inibida e, com isso, mantém a Cdk1 fosforilada e inativa. O ponto de checagem da montagem do fuso: um único cinetócoro não ligado a microtúbulos produz um inibidor difusível (a Mad2 ligada à Cdc20) que mantém o APC/C desligado, de modo que a anáfase espera pelo último cromossomo. Um quarto controle não tem etapa de espera, mas é igualmente estrito: o licenciamento da replicação. As origens são carregadas com a helicase MCM somente em G1, quando a atividade das CDKs está baixa, e os fatores de carregamento são destruídos ou inibidos assim que a fase S começa, de modo que cada origem dispara uma única vez por ciclo — a razão pela qual um núcleo em G2, nas fusões de Rao e Johnson, não podia ser levado a replicar.

Proposição 10.5 (O ponto de restrição é um interruptor)

No início de G1 o fator de transcrição E2F, que impulsiona os genes da fase S (ciclina E, ciclina A, as enzimas da replicação), é mantido inativo pela proteína do retinoblastoma Rb. Os fatores de crescimento induzem a ciclina D, e a ciclina D–Cdk4/6 começa a fosforilar a Rb, liberando um pouco de E2F; o E2F então induz a ciclina E, e a ciclina E–Cdk2 fosforila a Rb muito mais — uma retroalimentação positiva que, uma vez passado um limiar, se completa sem mais fator de crescimento. A célula cruzou o ponto de restrição; o E2F também induz seu próprio gene. A perda da Rb, ou do inibidor de Cdk4/6 p16, ou a amplificação da ciclina D, elimina por completo a exigência de fator de crescimento, e cada uma delas é comum no câncer (Capítulo 11); fármacos que inibem a Cdk4/6 são hoje usados contra cânceres de mama que dependem desse interruptor.

O ponto de restrição. Os fatores de crescimento iniciam a fosforilação da Rb, que libera um pouco de E2F; o E2F induz a ciclina E, cuja cinase fosforila ainda mais a Rb — uma retroalimentação positiva que completa a transição e a torna independente do sinal inicial. As barras marcam inibição.

Proposição 10.6 (A anáfase é uma decisão proteolítica)

As cromátides irmãs são mantidas juntas desde a fase S por anéis de coesina. Na metáfase, quando cada cinetócoro está ligado e o ponto de checagem do fuso foi silenciado, o APC/C com seu ativador Cdc20 ubiquitina duas proteínas: a ciclina B, cuja perda inativa a Cdk1 e permite à célula sair da mitose, e a securina, cuja perda libera a protease separase, que corta a coesina. Todos os pares de irmãs se separam com segundos de diferença entre si, puxados aos polos pelo fuso, e a célula se divide por um anel de actina e miosina II montado onde a zona média do fuso indica ao córtex (por meio da RhoA). A decisão é irreversível porque é proteolítica: uma coesina cortada não pode ser remontada, e a ciclina degradada precisa ser ressintetizada. Os erros aqui — um cromossomo puxado ao polo errado, uma anáfase iniciada antes da última ligação — produzem células-filhas aneuploides, a anormalidade cromossômica mais comum dos tumores e dos abortos espontâneos.

À esquerda: uma célula em metáfase — microtúbulos do fuso (verde) vindos dos dois polos (vermelho), cromossomos (azul) alinhados na placa, o momento em que o ponto de checagem do fuso decide. À direita: levedura de brotamento, do tipo selvagem com brotos de todos os tamanhos (à esquerda) e um mutante cdc em que cada célula parou na mesma etapa, cada uma com um broto do mesmo tamanho (à direita). — À esquerda: uma célula em metáfase — microtúbulos do fuso (verde) vindos dos dois polos (vermelho), cromossomos (azul) alinhados na placa, o momento em que o ponto de checagem do fuso decide. À direita: levedura de brotamento, do tipo selvagem com brotos de todos os tamanhos (à esquerda) e um mutante *cdc* em que cada célula parou na mesma etapa, cada uma com um broto do mesmo tamanho (à direita).

10.3 Apoptose

Definição 10.7 (Apoptose)

A apoptose é a morte celular programada por uma sequência intrínseca: a célula encolhe e se arredonda, sua cromatina se condensa e seu DNA é cortado entre os nucleossomos numa escada de fragmentos, o núcleo se desfaz, a membrana forma bolhas seladas, a fosfatidilserina aparece na face externa da membrana como um sinal de “coma-me”, e os fragmentos são englobados por vizinhos ou por macrófagos em menos de uma hora — sem vazamento e, portanto, sem inflamação. Ela é executada pelas caspases, proteases de cisteína que cortam depois de um aspartato, feitas como zimogênios inativos: as caspases iniciadoras (8 e 9) são ativadas por serem reunidas numa plataforma, e clivam e ativam as caspases executoras (3 e 7), que cortam várias centenas de substratos — as lâminas, o citoesqueleto, o inibidor da nuclease que corta o DNA, a enzima que mantém a fosfatidilserina do lado de dentro. A necrose, em contraste, é a morte por injúria: a célula incha, rompe-se, derrama seu conteúdo e provoca inflamação. A apoptose foi nomeada e sua morfologia descrita por Kerr, Wyllie e Currie (1972); seus genes foram achados num verme.

Evidência. Todo hermafrodita de Caenorhabditis elegans produz $1090$ células somáticas, das quais as mesmas $131$ morrem, cada uma num momento e num lugar fixos. Horvitz e colaboradores (anos 1980) isolaram mutantes em que elas sobreviviam: ced-3 e ced-4 eram necessários a cada morte e, na ausência deles, as $131$ células viviam e se diferenciavam; ced-9 protegia — sua perda matava células que deveriam ter vivido, e seu excesso de atividade salvava células que deveriam ter morrido; egl-1 era necessário a mortes particulares. A CED-3 era uma caspase, a CED-4 sua plataforma de ativação (a Apaf-1 nos humanos), a CED-9 uma proteína Bcl-2, a EGL-1 uma proteína só-BH3: a via humana, gene por gene. O próprio gene humano BCL2 havia sido encontrado numa translocação cromossômica no linfoma folicular, um câncer de células que não morrem. ∎

Definição 10.8 (As duas vias)

A via intrínseca (mitocondrial) integra o estado interno da célula. A família Bcl-2 tem três classes: as guardiãs (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1), que se assentam na membrana externa da mitocôndria e a mantêm selada; as efetoras (Bax, Bak), que, quando ativadas, oligomerizam em poros nessa membrana; e as sensoras só-BH3 (Bim, Bid, Puma, Noxa, Bad), cada uma induzida ou ativada por um insulto particular — dano ao DNA pela p53 (Puma, Noxa), retirada de fator de crescimento (Bim, Bad), desprendimento, proteínas mal enoveladas —, que se ligam às guardiãs e liberam ou ativam as efetoras. Quando as efetoras vencem, a membrana externa é permeabilizada, o citocromo c vaza para o citosol, liga-se à Apaf-1 e forma o apoptossomo, que ativa a caspase 9. A via extrínseca começa do lado de fora: os receptores de morte (Fas, receptor de TNF, receptores de TRAIL), ligados por seus ligantes num linfócito matador ou num vizinho, agrupam-se, recrutam adaptadores e ativam a caspase 8, que cliva a caspase 3 diretamente e, por meio da Bid, também abre a rota mitocondrial. As duas vias convergem nas caspases executoras, e proteínas inibidoras (IAPs, FLIP) fixam o limiar ao longo do caminho.

As duas rotas até as caspases executoras. De fora para dentro, um receptor de morte ativa a caspase-8; de dentro para fora, a família Bcl-2 pesa o estado da célula e, quando as efetoras vencem, a mitocôndria libera o citocromo c e a caspase-9 é ativada. As duas convergem na caspase-3. — As duas rotas até as caspases executoras. De fora para dentro, um receptor de morte ativa a caspase-8; de dentro para fora, a família Bcl-2 pesa o estado da célula e, quando as efetoras vencem, a mitocôndria libera o citocromo $c$ e a caspase-9 é ativada. As duas convergem na caspase-3.

Proposição 10.9 (O ponto sem volta)

A permeabilização da membrana externa mitocondrial é súbita — todas as mitocôndrias de uma célula se abrem em cerca de cinco minutos, depois de horas de deliberação — e completa: uma vez o citocromo $c$ no citosol, a ativação das caspases segue em minutos e não pode ser desfeita retirando o estímulo. Duas características fazem dela um interruptor. O poro de Bax/Bak se forma por oligomerização, de modo que sua taxa sobe abruptamente com a quantidade de efetora ativada; e as guardiãs e as sensoras se ligam umas às outras com alta afinidade, de modo que, até um limiar, toda sensora é neutralizada e, além dele, toda sensora a mais fica livre — uma titulação, como um tampão que se esgota. A célula, portanto, não morre aos poucos; ela acumula proteínas só-BH3 até que um limiar seja cruzado, e então morre de uma vez. Fármacos que imitam as proteínas BH3 (o venetoclax, que ocupa a Bcl-2) empurram para além do limiar as células que estão “preparadas” — já perto dele, como são muitas células leucêmicas —, poupando as que não estão.

Uma célula apoptótica ao lado de uma saudável no microscópio eletrônico de varredura: encolhida, com a superfície quebrada em bolhas seladas que serão englobadas sem um traço de inflamação.

Exemplo 10.10 (Mortes que constroem um corpo)

Os dedos são esculpidos de uma pá pela apoptose das células entre eles; no pato as mesmas células vivem e a membrana permanece. A cauda do girino é reabsorvida na metamorfose ao sinal do hormônio tireoidiano. Cerca de metade dos neurônios produzidos no sistema nervoso de um vertebrado morre antes do nascimento, justamente os que não recebem fator trófico bastante de seus alvos — uma competição que ajusta o número de neurônios ao tamanho do campo que eles servem. Noventa e cinco por cento dos linfócitos T feitos no timo morrem ali, selecionados negativamente por não reconhecerem nada ou por reconhecerem o próprio corpo (Capítulo 16). E todo dia o epitélio intestinal descarta suas células mais velhas nas pontas das vilosidades, a pele seus queratinócitos, o sangue seus neutrófilos envelhecidos depois de uma vida de um dia: a apoptose é a rotina, e o tamanho do tecido é a diferença entre duas taxas grandes.

10.4 Outras saídas, e a falha em sair

Definição 10.11 (Necrose regulada e senescência)

As células têm outras mortes programadas, todas inflamatórias, ao passo que a apoptose é silenciosa. A necroptose, disparada por receptores de morte quando a caspase-8 está bloqueada (como alguns vírus a bloqueiam), monta a cinase RIPK3 com a MLKL, que perfura a membrana plasmática. A piroptose, em macrófagos infectados, é executada pela caspase-1 do inflamassomo (Capítulo 15), que cliva a gasdermina num formador de poros e libera a interleucina-1. A ferroptose é a morte por peroxidação lipídica dependente de ferro. Uma célula também pode parar de se dividir sem morrer: a senescência é uma parada permanente, imposta pela p16 e pela p21 depois da erosão dos telômeros (Capítulo 24), de dano persistente ao DNA ou da ativação de um oncogene, na qual a célula permanece metabolicamente ativa e secreta fatores inflamatórios. A senescência remove células danificadas do conjunto em divisão — um supressor de tumor — e se acumula com a idade, quando suas secreções contribuem para a degeneração dos tecidos; eliminar células senescentes em camundongos prolonga a vida saudável.

Observação 10.12 (Pouco demais e demais)

As doenças desses programas são de dose. Morte de menos: o câncer, em que o limiar apoptótico é elevado pela superexpressão de Bcl-2 ou pela perda de p53, de modo que células com genomas danificados sobrevivem para acumular mais dano; a autoimunidade, quando linfócitos que deveriam ter morrido na seleção persistem. Morte demais: a perda de linfócitos T na infecção pelo HIV, os neurônios da penumbra de um acidente vascular morrendo por apoptose horas depois da isquemia (uma janela para tratamento), a apoptose lenta de neurônios nas doenças neurodegenerativas, as células cardíacas perdidas depois de um infarto. O tratamento do câncer é, em grande medida, a indução deliberada de apoptose em células cujos limiares são mais baixos que os das vizinhas, e os fármacos que miram a Bcl-2 e a Cdk4/6 são os primeiros projetados a partir dos mapas deste capítulo.

10.5 Exercícios

Exercício 10.1 ★

Liste as quatro fases do ciclo, o par ciclina–CDK que impulsiona cada transição e a ubiquitina-ligase que encerra a mitose.

Solução

Solução de Exercício 10.1.

G1, S, G2, M. Progressão em G1 e ponto de restrição: ciclina D–Cdk4/6; G1/S: ciclina E–Cdk2; S: ciclina A–Cdk2; G2/M: ciclina B–Cdk1. O complexo promotor da anáfase (APC/C) destrói a ciclina B e a securina e encerra a mitose.

Exercício 10.2 ★

Com que cada um de Hartwell, Nurse e Hunt contribuiu para a descoberta do motor, e em que organismo?

Solução

Solução de Exercício 10.2.

Hartwell: os mutantes cdc da levedura de brotamento, parados em etapas definidas, e o conceito de Start. Nurse: o cdc2 da levedura de fissão como a cinase que marca o tempo da mitose, e seu homólogo humano (Cdk1) resgatando a levedura — a conservação. Hunt: a ciclina em óvulos de ouriço-do-mar, uma proteína sintetizada ao longo do ciclo e destruída a cada divisão.

Exercício 10.3 ★

Nomeie os três pontos de checagem, a condição que cada um testa e o alvo molecular sobre o qual cada um age.

Solução

Solução de Exercício 10.3.

Ponto de restrição (fim de G1): fatores de crescimento, nutrientes, tamanho; age sobre a ciclina D–Cdk4/6 e sobre a Rb. G2/M: DNA intacto e replicado; a ATM/ATR inibem a Cdc25, mantendo a Cdk1 fosforilada e inativa. Montagem do fuso: cada cinetócoro ligado; cinetócoros não ligados produzem complexos Mad2–Cdc20 que inibem o APC/C.

Exercício 10.4 ★

Distinga a apoptose da necrose em cinco características, e nomeie a classe de enzimas que executa a apoptose.

Solução

Solução de Exercício 10.4.

Apoptose: a célula encolhe, a cromatina se condensa, o DNA é cortado numa escada, a membrana forma bolhas, mas permanece selada, a fosfatidilserina fica exposta, o corpo é englobado, não há inflamação. Necrose: a célula incha, a membrana se rompe, o conteúdo vaza, o DNA é degradado ao acaso, há inflamação. Executoras: as caspases, proteases de cisteína que cortam depois de um aspartato.

Exercício 10.5 ★★

Num extrato de óvulo de rã a ciclina B é sintetizada a $k_{s} = 1$ unidade por minuto; o limiar mitótico é $C_{2} = 30$ unidades, o limiar de saída é $C_{1} = 5$ , e na mitose a ciclina é degradada com meia-vida de $2\,\mathrm{min}$ . Estime o período da oscilação e a fração do ciclo passada em mitose.

Solução

Solução de Exercício 10.5.

Subida de $5$ a $30$ a $1$ por minuto: $25\,\mathrm{min}$ . Degradação de $30$ a $5$ com meia-vida de $2\,\mathrm{min}$ : $\log_{2}(30/5)\times 2 = 5.2\,\mathrm{min}$ . Período de cerca de $30\,\mathrm{min}$ , com a mitose ocupando $17\,\%$ dele.

Exercício 10.6 ★★

Preveja o comportamento de uma célula (a) que expressa uma ciclina B não degradável, (b) sem Wee1, (c) sem Cdc25, (d) que expressa uma Cdk1 que não pode ser fosforilada pela Wee1, em termos do oscilador do Teorema 10.2.

Solução

Solução de Exercício 10.6.

(a) $C$ nunca pode cair abaixo de $C_{1}$ : travada em mitose, no ramo alto. (b) Sem a fosforilação inibitória: o limiar $C_{2}$ baixa, e a mitose começa cedo, num tamanho pequeno (o fenótipo “wee”). (c) A Cdk1 permanece fosforilada: o ramo alto fica inalcançável, com parada em G2 e células alongadas. (d) Como em (b), e o ponto de checagem G2/M, que age por meio de Wee1/Cdc25, já não consegue segurar a célula.

Exercício 10.7 ★★

Uma fusão de Rao–Johnson junta uma célula em G1 a uma célula em fase S; outra junta uma célula em G2 a uma em fase S. Preveja o que cada núcleo faz e explique com o licenciamento e os níveis de CDK.

Solução

Solução de Exercício 10.7.

Núcleo em G1 em citoplasma de fase S: suas origens estão licenciadas e o citoplasma fornece ciclina E/A–Cdk2 ativa, de modo que ele entra em S de imediato. Núcleo em G2 em citoplasma de fase S: suas origens já dispararam e não foram relicenciadas (os fatores de licenciamento foram destruídos ou inibidos pelas CDKs), de modo que ele não pode replicar de novo; espera até que o parceiro chegue a G2 e os dois entrem juntos em mitose.

Exercício 10.8 ★★

Explique por que um único cinetócoro não ligado consegue segurar a anáfase da célula inteira, e preveja o destino de uma célula em que a Mad2 foi deletada.

Solução

Solução de Exercício 10.8.

O cinetócoro não ligado é um catalisador: ele converte continuamente a Mad2 em sua conformação ativa, produzindo um inibidor difusível da Cdc20 que se espalha pela célula e mantém o APC/C desligado em toda parte — um único cinetócoro basta. Sem a Mad2, o APC/C é ativado assim que a Cdk1 o liga, estejam ou não os cromossomos ligados: a anáfase começa com cromossomos soltos, as filhas ficam aneuploides, e o organismo (ou a linhagem celular) morre de perda de cromossomos.

Exercício 10.9 ★★

Preveja o fenótipo de um verme sem ced-9; sem ced-3; sem os dois. Explique a epistasia em termos da via.

Solução

Solução de Exercício 10.9.

Sem ced-9: células que deveriam viver morrem — letalidade embrionária por morte demais. Sem ced-3: nenhuma das $131$ mortes ocorre, as células sobrevivem e se diferenciam, e o verme é viável. Sem os dois: nenhuma morte — o fenótipo de ced-3. Como remover a executora cancela o efeito de remover a guardiã, a CED-9 age a montante, mantendo CED-4/CED-3 inativas; quando ela se vai, elas ficam ativas, a menos que também estejam ausentes.

Exercício 10.10 ★★★

Mostre que uma única alça de retroalimentação negativa sem interruptor biestável — ciclina sintetizada a $k_{s}$ , degradada a $k_{d}AC$ com $A$ simplesmente proporcional a $C$ — tem um estado estacionário estável e não oscila. O que a curva em S acrescenta, e o que um atraso acrescentaria em seu lugar?

Solução

Solução de Exercício 10.10.

Com $A = aC$ , $\mathrm{d}C/\mathrm{d}t = k_{s} - k_{d}aC^{2}$ , uma equação de uma variável com estado estacionário $C^{*} = \sqrt{k_{s}/(k_{d}a)}$ e inclinação $-2k_{d}aC^{*} < 0$ ali: qualquer desvio decai monotonicamente, e uma única variável de primeira ordem não pode oscilar. A curva em S dá dois ramos estáveis separados por uma zona proibida, de modo que o estado precisa saltar e não pode se assentar; um atraso explícito na retroalimentação daria oscilações por outra rota — o freio chegando tarde demais, ultrapassando o ponto e assim por diante —, como em muitos ritmos hormonais.

Exercício 10.11 ★★★

Uma célula tem $N$ moléculas da guardiã Bcl-2 e recebe sensoras só-BH3 a uma taxa $r$ por hora depois de um estímulo danoso, cada sensora ligando uma guardiã. Explique por que a célula morre por volta do instante $N/r$ seja qual for a intensidade do estímulo além disso, por que a morte é súbita, e o que o venetoclax faz a esse tempo.

Solução

Solução de Exercício 10.11.

Cada sensora que chega é capturada por uma guardiã, de modo que nada acontece até que todas as $N$ guardiãs estejam ocupadas, em $t \approx N/r$ ; as sensoras seguintes ficam livres, ativam Bax/Bak, cuja formação de poros sobe abruptamente com o número delas, e as mitocôndrias se abrem em minutos. Um estímulo mais forte encurta o tempo apenas por meio de $r$ ; acima do limiar o desfecho é o mesmo. O venetoclax ocupa guardiãs, reduzindo o $N$ efetivo: o tempo encolhe, e uma célula preparada — já perto de $N$ — morre de imediato.

Exercício 10.12 ★★★

O linfoma folicular carrega uma translocação que superexpressa o BCL2; suas células se dividem devagar. O retinoblastoma carrega a perda do RB; suas células se dividem depressa. Explique como cada lesão isolada produz um tumor, por que o primeiro é indolente e o segundo agressivo, e o que cada um diz sobre os dois programas deste capítulo.

Solução

Solução de Exercício 10.12.

O excesso de Bcl-2 bloqueia a via intrínseca: os linfócitos B que deveriam morrer quando seus sinais de crescimento acabam sobrevivem, e a população cresce por falha de morte, à taxa lenta com que tais células são feitas — indolente, até que uma segunda lesão acrescente proliferação. A perda da Rb remove o ponto de restrição: os precursores da retina percorrem o ciclo sem fatores de crescimento e se dividem tão depressa quanto o motor permite — agressivo. Os dois tumores são os dois programas falhando cada um por si: um controle de morte e um controle de divisão, bastando a perda de qualquer um deles para um tumor, o segundo mais rápido.

10.6 Problema: a vida e a morte de um epitélio

Problema 10.1

Problema de fim de semana — o revestimento intestinal renovado célula a célula, o ciclo cronometrado pelo oscilador de ciclina, os erros de um ponto de checagem contados por todo o corpo e o descarte apoptótico de cem bilhões de células por dia pesado, terminando no período do ciclo, nas células aneuploides produzidas por dia e na massa que o corpo recicla por apoptose

Dados: o intestino delgado tem $10^{7}$ criptas, cada uma renovando uma vilosidade de $3500$ células a cada $5$ dias; cada cripta abriga cerca de $22$ células-tronco que se dividem uma vez por dia, e cuja progênie se divide mais $5$ vezes antes de se diferenciar. Oscilador: $k_{s} = 2$ unidades de ciclina por hora, $C_{2} = 40$ unidades, $C_{1} = 8$ , meia-vida da ciclina mitótica $10\,\mathrm{min}$ . Ponto de checagem: sem o ponto de checagem do fuso, uma divisão em $50$ segrega mal um cromossomo; com ele, uma em $50\,000$ . O corpo substitui $10^{11}$ células por dia, de massa $1\,\mathrm{ng}$ cada, com proteína correspondendo a $20\,\%$ da massa; um macrófago limpa uma célula apoptótica em $1\,\mathrm{h}$ .

Parte I — Renovação.

Quantas células o intestino delgado descarta por dia, e por segundo?
Quantas células uma cripta produz por dia? Confira: $22$ divisões de células-tronco por dia, cada filha comprometida se dividindo mais $5$ vezes.
Se uma célula-tronco se divide uma vez por dia durante uma vida de $80$ anos, quantas divisões? Com uma taxa de mutação de $0.6$ por genoma por divisão (Capítulo 3), quantas mutações ela acumula?
As células de trânsito se dividem a cada $12\,\mathrm{h}$ . Por que o tecido pode se dar ao luxo de divisões de trânsito rápidas e de vida curta, mas mantém a célula-tronco lenta?
Uma dose de radiação mata todas as células de trânsito em divisão, mas poupa as células-tronco, que retomam em um dia. Quanto tempo até a vilosidade, sem reposição, ficar nua, e quanto tempo para reconstruí-la? Por que o intestino é uma das primeiras vítimas da radiação?
No cólon o descarte no topo se dá por apoptose (anoikis, morte por desprendimento). Por que esse é o modo de morte certo para uma célula em contato com as bactérias do intestino?

Parte II — O relógio.

Com os dados do oscilador, quanto tempo a ciclina leva para subir de $C_{1}$ a $C_{2}$ ?
Quanto tempo a degradação mitótica leva para trazê-la de $C_{2}$ de volta a $C_{1}$ ?
Período do oscilador nu, e fração do período passada com a Cdk1 ativa.
As células de trânsito da cripta ciclam em $12\,\mathrm{h}$ , as células-tronco em $24\,\mathrm{h}$ , o óvulo de rã em $30\,\mathrm{min}$ . Qual dos parâmetros do modelo difere, e o que fornece a diferença numa célula somática?
Uma célula parada no ponto de checagem G2/M por dano ao DNA continua produzindo ciclina B. Onde ela está no plano de fase, e o que a mantém ali? O que acontece quando o dano é reparado?
Um fármaco inibe o APC/C. Descreva o destino de uma célula que entre em mitose na presença dele.

Parte III — Erros.

Quantas divisões por dia o corpo realiza para substituir $10^{11}$ células?
Quantas filhas aneuploides por dia com o ponto de checagem, e sem ele?
A maioria das células aneuploides morre ou para (a p53 responde à má segregação). Se $1\,\%$ sobrevive e se divide, quantas células aneuploides em divisão um corpo com ponto de checagem competente produz por dia, e ao longo de uma vida?
Um tumor de $10^{9}$ células perdeu o ponto de checagem e a p53. Quantas más segregações por dia ele realiza, e por que isso o faz evoluir depressa?
Explique por que a perda completa do ponto de checagem do fuso é letal para um embrião, embora a perda parcial promova o câncer.
A síndrome de Down surge de uma má segregação na meiose, não na mitose. Explique por que um erro numa única célula ali afeta cada célula da criança, ao passo que um erro mitótico afeta uma linhagem.

Parte IV — Descarte.

Que massa de células o corpo descarta por apoptose por dia, e por ano? Compare com a massa corporal.
Quanta proteína é isso por dia? Compare com uma ingestão alimentar de $70\,\mathrm{g}$ : que fração da renovação proteica do corpo é a reciclagem das células mortas?
Quantos macrófagos, trabalhando sem parar, são necessários para limpar os mortos do dia? O corpo tem cerca de $10^{11}$ macrófagos: que fração do tempo deles?
Por que o corpo precisa ser removido antes de se lisar, e o que sinaliza “coma-me”?
A Bcl-2 de um paciente está superexpressa em linfócitos B. Qual via está bloqueada, a via extrínseca ainda funciona, e por que o resultado é um linfoma de crescimento lento, e não rápido?
Os neurônios da penumbra de um acidente vascular morrem por apoptose de seis a vinte e quatro horas depois do insulto, e os do núcleo por necrose em minutos. Por que o primeiro caso oferece uma janela para tratamento e o segundo não?
Resuma: o período do oscilador nu (questão 9), as células aneuploides em divisão por dia num corpo normal (questão 15) e a massa reciclada por apoptose por dia (questão 19).

Solução

Solução de Problema 10.1.

1. $10^{7}\times 3500/5 = 7\times 10^{9}$ células por dia, cerca de $80\,000$ por segundo. 2. $3500/5 = 700$ por cripta por dia; $22\times 2^{5} = 704$ . 3. $80\times 365 \approx 29\,000$ divisões; $\times 0.6 \approx 17\,500$ mutações. 4. As células de trânsito são descartadas em dias, levando consigo suas mutações; a célula-tronco persiste a vida toda, de modo que cada uma de suas mutações é conservada e cada divisão acrescenta mais — ciclar devagar as minimiza. 5. A vilosidade se esvazia nos cerca de $5$ dias de seu trânsito normal; reconstruí-la leva um dia de recuperação, cinco divisões a cada $12\,\mathrm{h}$ e a migração vilosidade acima — quatro a cinco dias, durante os quais a barreira fica nua: as divisões rápidas de trânsito do intestino fazem dele uma das primeiras vítimas da radiação. 6. Um corpo apoptótico selado não libera conteúdo algum num lúmen cheio de bactérias e não provoca inflamação; a necrose derramaria enzimas e sinais e inflamaria a mucosa a cada célula descartada. 7. $(40 - 8)/2 = 16\,\mathrm{h}$ . 8. $\log_{2}(40/8)\times 10\,\mathrm{min} = 2.3\times 10 = 23\,\mathrm{min}$ . 9. Período de cerca de $16.4\,\mathrm{h}$ ; a Cdk1 fica ativa $2.3\,\%$ do tempo. 10. Não é o $k_{s}$ sozinho, mas o tempo em que a célula é segurada nos limiares: a célula somática espera no ponto de restrição por fatores de crescimento e em G2/M por seu DNA, e a célula-tronco espera mais que a de trânsito. O óvulo de rã não tem pontos de checagem e tem um citoplasma abastecido de tudo, de modo que só o oscilador nu fixa seu período. 11. No ramo baixo, num nível de ciclina acima do $C_{2}$ normal: o ponto de checagem deslocou a curva em S para a direita ao inibir a Cdc25, e por isso o salto não ocorre. Com o reparo, a Cdc25 é liberada, o limiar cai abaixo da ciclina acumulada, e a célula entra em mitose de imediato — razão pela qual células liberadas de um ponto de checagem entram em mitose de modo sincronizado. 12. Nem a ciclina B nem a securina são degradadas: a célula permanece em metáfase, com a coesina intacta e a Cdk1 ativa, indefinidamente; ela morre ali ou acaba escapando com um genoma não segregado. 13. $10^{11}$ divisões por dia. 14. Com o ponto de checagem, $10^{11}/5\times 10^{4} = 2\times 10^{6}$ filhas aneuploides por dia; sem ele, $2\times 10^{9}$ . 15. $2\times 10^{4}$ por dia; ao longo de $80$ anos, $6\times 10^{8}$ . 16. $10^{9}/50 = 2\times 10^{7}$ más segregações por dia: todo dia o tumor tenta vinte milhões de cariótipos novos, e a seleção guarda os que crescem mais depressa ou resistem a um fármaco. 17. Com cada divisão segregando mal, nenhuma linhagem celular embrionária conserva um genoma euploide e o embrião morre. A perda parcial dá aneuploidia ocasional em células que a sobrevivem (sobretudo sem p53), uma instabilidade cromossômica que fornece variação a um tumor sem matar o organismo. 18. Um erro meiótico põe o cromossomo extra no gameta, de modo que o zigoto e cada célula dele derivada são trissômicos; um erro mitótico ocorre numa célula somática e é herdado apenas por seu clone. 19. $10^{11}\times 1\,\mathrm{ng} = 100\,\mathrm{g}$ por dia, $36\,\mathrm{kg}$ por ano — cerca de metade da massa do corpo a cada ano. 20. $20\,\mathrm{g}$ de proteína por dia, cerca de um terço da ingestão alimentar e alguns por cento da renovação proteica total do corpo. 21. $10^{11}$ corpos a $24$ por macrófago por dia: $4\times 10^{9}$ macrófagos em tempo integral, $4\,\%$ do tempo dos $10^{11}$ macrófagos. 22. Um corpo lisado libera proteases, DNA, ATP e outros sinais de alarme que causam inflamação e podem provocar autoimunidade contra antígenos nucleares; o corpo intacto se anuncia com fosfatidilserina em sua monocamada externa (e pela perda de seus sinais de “não me coma”) e atrai fagócitos com nucleotídeos liberados. 23. A via intrínseca está bloqueada na mitocôndria. A rota extrínseca ainda funciona onde a caspase-8 ativa a caspase-3 diretamente, embora sua amplificação pela Bid se perca. As células se acumulam por não morrer, e não por se dividirem mais depressa — crescimento lento —, até que uma lesão posterior (muitas vezes o MYC) acrescente proliferação. 24. A apoptose leva horas, precisa de ATP e passa por etapas que podem ser bloqueadas — inibidores de caspase, o limiar mitocondrial —, de modo que os neurônios da penumbra podem ser resgatados se tratados a tempo; os neurônios do núcleo morrem de falha energética em minutos, sem programa algum a interromper. 25. Período do oscilador nu de cerca de $16\,\mathrm{h}$ ; uns $2\times 10^{4}$ células aneuploides em divisão por dia num corpo normal; $100\,\mathrm{g}$ de células recicladas por apoptose a cada dia.

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