Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

12Bacteriologia: crescimento, fisiologia e genética

Uma única célula de Escherichia coli em caldo morno se divide a cada vinte minutos. Se nada a detivesse, seus descendentes pesariam mais que a Terra em dois dias; de fato eles param em poucas horas, quando o açúcar acaba, e ficam por semanas num estado que sobrevive à inanição. Uma bactéria aparentada, dados um ferimento e algumas horas, torna-se cem milhões de células e uma febre; cem anos atrás ela matava um terço dos pacientes que infectava, e desde 1941 o veneno de um mofo contra ela salvou mais vidas que qualquer outro fármaco — enquanto as bactérias, nesses mesmos oitenta anos, evoluíram maneiras de contornar cada antibiótico já feito. As bactérias foram os organismos em que se mostrou pela primeira vez que os genes são DNA, em que a regulação gênica foi compreendida primeiro, e de que se tiraram as ferramentas do Capítulo 6. Este capítulo as trata como organismos: seu envoltório, a aritmética de seu crescimento num frasco e numa cultura contínua, o modo como uma população percebe sua própria densidade, o tráfego de genes entre células, e a química e a evolução dos antibióticos e da resistência.

12.1 A célula bacteriana

Definição 12.1 (O envoltório)

Toda bactéria, salvo umas poucas, é envolvida por uma parede de peptidoglicano: cadeias alternadas de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico, com ligações cruzadas de peptídeos curtos que as unem numa única molécula, a qual cerca a célula e resiste à pressão de turgor — de várias atmosferas — do citoplasma. As bactérias Gram-positivas têm uma parede espessa de $20\text{ a }80\,\mathrm{nm}$ , de muitas camadas, entremeada de ácidos teicoicos; as Gram-negativas têm uma parede fina de uma ou duas camadas e, fora dela, uma segunda bicamada lipídica, a membrana externa, cuja monocamada externa é lipopolissacarídeo (LPS, a endotoxina — a molécula que o sistema imune inato do Capítulo 15 reconhece e que causa o choque séptico), e que fecha um periplasma. Porinas na membrana externa deixam entrar moléculas pequenas e barram muitos antibióticos. Por fora pode haver uma cápsula de polissacarídeo contra os fagócitos, flagelos para nadar (Capítulo 9) e pili para adesão e conjugação. Por dentro, o cromossomo — uma molécula circular de $1\text{ a }10\,\mathrm{Mb}$ na maioria das espécies — é dobrado num nucleoide sem membrana, ao lado dos plasmídeos. Alguns gêneros (Bacillus, Clostridium) conseguem encerrar uma cópia do cromossomo num revestimento espesso como endósporo, desidratado e metabolicamente inerte, que sobrevive à fervura, à radiação e a séculos de seca e germina quando os nutrientes voltam.

Método 12.2 (A coloração de Gram)

O teste mais antigo do laboratório de bacteriologia (Gram, 1884) ainda decide a primeira escolha de antibiótico. (1) Faça um esfregaço da amostra e fixe-o pelo calor; (2) core com cristal violeta e depois com iodo, que forma com o corante um grande complexo insolúvel dentro das células; (3) lave com álcool: o peptidoglicano espesso das Gram-positivas, desidratado pelo álcool, aprisiona o complexo e as células ficam roxas, ao passo que a parede fina das Gram-negativas o deixa sair; (4) contracore com safranina, que tinge de rosa as Gram-negativas agora incolores. A forma e o arranjo — cocos em cachos (estafilococos) ou em cadeias (estreptococos), bastonetes, espirais — estreitam ainda mais a identificação, e um coco roxo em cachos vindo de um abscesso é um estafilococo antes que qualquer cultura tenha crescido.

À esquerda: uma coloração de Gram — cocos Gram-positivos roxos em cachos, bastonetes Gram-negativos rosados. À direita: células de Bacillus coradas para endósporos, os ovais verde-brilhantes dentro de células rosadas e esporos livres ao lado delas. — À esquerda: uma coloração de Gram — cocos Gram-positivos roxos em cachos, bastonetes Gram-negativos rosados. À direita: células de *Bacillus* coradas para endósporos, os ovais verde-brilhantes dentro de células rosadas e esporos livres ao lado delas.

Os dois envoltórios. As Gram-positivas envolvem a membrana em muitas camadas de peptidoglicano; as Gram-negativas têm uma camada fina e uma membrana externa de lipopolissacarídeo perfurada por porinas, que barra muitos antibióticos e produz a endotoxina que causa o choque séptico.

12.2 Crescimento

Teorema 12.3 (Crescimento exponencial, a lei de Monod e o quimiostato)

Uma população de $N$ células que se dividem com tempo de geração $T$ cresce como $N(t) = N_{0}\,2^{t/T} = N_{0}e^{\mu t}$ , com taxa específica de crescimento $\mu = \ln 2/T$ . A taxa depende do nutriente limitante $S$ pela lei de Monod

\mu(S) = \mu_{\max}\,\frac{S}{K_{S} + S},

saturando em $\mu_{\max}$ e valendo a metade do máximo em $S = K_{S}$ . Num quimiostato — um recipiente de volume $V$ no qual entra meio fresco de concentração de nutriente $S_{0}$ à vazão $F$ , e do qual sai cultura à mesma vazão, com taxa de diluição $D = F/V$ —, o estado estacionário tem

\mu(S^{*}) = D,\qquad S^{*} = \frac{K_{S}D}{\mu_{\max} - D},\qquad X^{*} = Y\,(S_{0} - S^{*}),

em que $X$ é a densidade celular e $Y$ o rendimento (células feitas por unidade de nutriente). O experimentador fixa a taxa de crescimento girando um botão de bomba; a cultura responde ajustando o nutriente que deixa para trás. Se $D$ exceder $\mu(S_{0})$ , as células não conseguem acompanhar e são lavadas para fora.

Demonstração. Células: $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t = \mu(S)X - DX$ , crescimento menos saída; no estado estacionário com $X^{*} > 0$ , $\mu(S^{*}) = D$ , e inverter a lei de Monod dá $S^{*}$ . Nutriente: $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = D(S_{0} - S) - \mu(S)X/Y$ , entrada menos saída menos consumo; no estado estacionário, com $\mu = D$ , $D(S_{0} - S^{*}) = DX^{*}/Y$ , de onde vem $X^{*}$ . O estado estacionário só existe se $S^{*} < S_{0}$ , isto é, se $D < \mu(S_{0})$ ; além disso o único estado estacionário é $X = 0$ , a lavagem. Estabilidade: se $X$ sobe acima de $X^{*}$ , ele consome mais, $S$ cai abaixo de $S^{*}$ , $\mu$ cai abaixo de $D$ e $X$ declina — uma retroalimentação negativa pelo nutriente. ∎

Exemplo 12.4 (Uma cultura em números)

E. coli em meio rico a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $T = 20\,\mathrm{min}$ , $\mu = 2.1\,\mathrm{h}^{-1}$ . A partir de uma célula, $2^{36}$ depois de doze horas — $7\times 10^{10}$ células, cerca de $70\,\mathrm{mg}$ , que é onde um frasco de $100\,\mathrm{mL}$ para, por falta de oxigênio e de açúcar; a “massa da Terra em dois dias” corresponde a $2^{144}\approx 10^{43}$ células, e a aritmética mostra apenas que o crescimento exponencial nunca dura. Num quimiostato com glicose e $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ e $Y = 0.5\,\mathrm{g}$ de células por grama de glicose, uma taxa de diluição de $0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ deixa $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glicose e mantém $X^{*} = 0.495\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de células, dividindo-se a cada $83\,\mathrm{min}$ , indefinidamente. O quimiostato é como se estuda a fisiologia a uma taxa de crescimento fixa, e como se rodam milhares de gerações de evolução numa garrafa.

À esquerda: uma cultura em lote — uma latência enquanto as enzimas são induzidas, o crescimento exponencial, uma fase estacionária quando o nutriente se esgota, e a morte lenta. À direita: a lei de Monod, a taxa de crescimento contra o nutriente limitante, com K_S sendo a concentração de crescimento meio máximo. — À esquerda: uma cultura em lote — uma latência enquanto as enzimas são induzidas, o crescimento exponencial, uma fase estacionária quando o nutriente se esgota, e a morte lenta. À direita: a lei de Monod, a taxa de crescimento contra o nutriente limitante, com $K_{S}$ sendo a concentração de crescimento meio máximo.

Definição 12.5 (Fases e estados)

Num frasco fresco (uma cultura em lote) as células primeiro pausam — a fase de latência, enquanto induzem as enzimas de que o meio novo precisa —, depois crescem exponencialmente, e depois param quando um nutriente se esgota ou um resíduo se acumula: a fase estacionária, em que as células encolhem, espessam seu envoltório, condensam seu nucleoide em torno de proteínas protetoras, ligam genes de estresse pelo fator sigma alternativo RpoS e podem sobreviver por meses; segue-se uma fase de morte em que a maioria das células se lisa e umas poucas vivem dos restos. Algumas espécies respondem à inanição com um programa de desenvolvimento: o Bacillus subtilis se divide assimetricamente, e a célula maior engolfa a menor e constrói o esporo em torno dela, uma sequência de oito horas controlada por uma cascata de fatores sigma — as subunidades que dirigem a RNA-polimerase a um conjunto de promotores — alternando entre os dois compartimentos, o primeiro exemplo bacteriano de diferenciação e de sinalização de célula a célula através de uma parede.

12.3 Perceber uns aos outros

Definição 12.6 (Percepção de quórum)

As bactérias detectam sua própria densidade pela percepção de quórum: cada célula secreta uma pequena molécula de sinal, um autoindutor — homosserina-lactonas aciladas nas Gram-negativas, peptídeos curtos nas Gram-positivas — a uma taxa constante; a concentração no meio sobe com o número de células e, quando cruza um limiar, ela se liga a um receptor que liga um conjunto de genes, entre eles a sintase do próprio autoindutor (daí o nome). Os genes assim controlados são os que só compensam em companhia: a luz em Vibrio fischeri, os fatores de virulência em Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, a matriz de biofilme, a competência para captar DNA, e a morte dos vizinhos. A maior parte da percepção bacteriana passa por sistemas de dois componentes: uma histidina-cinase de membrana que detecta um estímulo e fosforila um regulador de resposta citoplasmático, que se liga ao DNA — uma célula tem dezenas, para fosfato, osmolaridade, oxigênio e os autoindutores de outras espécies.

Evidência. Nealson, Platt e Hastings (1970) cultivaram a bactéria marinha luminosa Vibrio fischeri a partir de um inóculo diluído e constataram que as células não faziam luz alguma até alcançarem uma densidade de uns $10^{7}$ por mililitro, e então todas se acendiam juntas; o meio em que uma cultura densa havia crescido, esterilizado e acrescentado a uma cultura diluída, acendia a luz de imediato. As células contavam uma substância secretada, e não o tempo ou o nutriente. A substância foi identificada como uma acil-homosserina-lactona (Eberhard, 1981), e os genes — luxI para a sintase, luxR para o receptor, e o óperon da luciferase que eles controlam — foram clonados em E. coli, que passou a brilhar quando apinhada. Na lula que abriga a bactéria a $10^{10}$ por mililitro, o órgão de luz brilha; no mar, onde as bactérias estão diluídas, elas ficam escuras e poupam o custo. ∎

Proposição 12.7 (Um limiar de densidade)

Sejam $N$ células num volume $V$ , cada uma secretando autoindutor à taxa $p$ moléculas por segundo, e seja a molécula perdida (degradada ou diluída) com taxa de primeira ordem $k$ . A concentração se aproxima de $A^{*} = pN/(kV)$ , proporcional à densidade celular $N/V$ , com constante de tempo $1/k$ ; o receptor liga quando $A^{*}$ alcança seu limiar $A_{\text{thr}}$ , isto é, na densidade

\left(\frac{N}{V}\right)_{\text{thr}} = \frac{k\,A_{\text{thr}}}{p}.

Num espaço fechado — o órgão de luz de uma lula, um abscesso, o muco de um pulmão — $k$ é pequeno porque o sinal não é levado embora, e por isso a densidade limiar é alcançada com menos células; em mar aberto ela nunca é alcançada. A célula, portanto, mede não seu número, mas seu número por unidade do volume que compartilha, que é o que importa para qualquer ato cooperativo; e a retroalimentação positiva do autoindutor sobre sua própria sintase torna o interruptor abrupto: uma vez que algumas células cruzem o limiar, a produção extra delas empurra as demais para o outro lado.

Demonstração. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = pN/V - kA$ tem o estado estacionário $A^{*} = pN/(kV)$ e relaxa até ele como $e^{-kt}$ . Fazer $A^{*} = A_{\text{thr}}$ e resolver para $N/V$ dá a densidade limiar. ∎

À esquerda: uma cultura densa de Vibrio fischeri brilhando, ao lado de uma diluída que está escura — as mesmas células, acima e abaixo de seu quórum. À direita: um teste de difusão em disco; o diâmetro de cada zona limpa mede a sensibilidade da bactéria ao antibiótico daquele disco, e o disco sem zona marca uma resistência. — À esquerda: uma cultura densa de *Vibrio fischeri* brilhando, ao lado de uma diluída que está escura — as mesmas células, acima e abaixo de seu quórum. À direita: um teste de difusão em disco; o diâmetro de cada zona limpa mede a sensibilidade da bactéria ao antibiótico daquele disco, e o disco sem zona marca uma resistência.

12.4 O tráfego de genes

Definição 12.8 (Transferência horizontal de genes)

As bactérias se reproduzem clonalmente, mas trocam genes por três rotas. A transformação: a captação de DNA nu do ambiente por uma célula competente — a rota pela qual os pneumococos de Griffith adquiriram sua cápsula e pela qual Avery mostrou que o princípio transformante era DNA (1944). A transdução: um fago que empacota um pedaço do DNA do hospedeiro e o injeta no hospedeiro seguinte (Capítulo 13). A conjugação: a transferência de um plasmídeo por um pilus e uma ponte de acasalamento, de um doador que o carrega a um receptor, demonstrada por Lederberg e Tatum (1946) com linhagens auxotróficas de E. coli que produziam recombinantes prototróficos apenas quando misturadas. Os plasmídeos conjugativos carregam seus próprios genes de transferência; muitos carregam também genes de resistência, muitas vezes agrupados em integrons e ladeados por transpósons, de modo que um único acasalamento pode transferir resistência a cinco antibióticos ao mesmo tempo, entre espécies. A consequência é que uma espécie bacteriana tem um genoma central compartilhado por todas as linhagens e um genoma acessório que varia — um pangenoma: duas linhagens de E. coli podem diferir num quinto de seus genes, e as linhagens patogênicas diferem das inofensivas sobretudo por ilhas adquiridas de genes de virulência. Os genes do capítulo de mutação do volume do 2.º ano surgem por mutação; os genes deste, em sua maioria, chegam.

As três rotas da transferência horizontal. Genes de resistência, de virulência e de metabolismo passam de célula a célula — e de espécie a espécie — mais depressa do que a mutação poderia fabricá-los.

Evidência. Robert Koch (1876–1884) estabeleceu que uma bactéria específica causa uma doença específica: isolou o Bacillus anthracis de animais doentes, cultivou-o em cultura pura em meio sólido (a placa de ágar e a colônia isolada são invenções de seu laboratório), mostrou que a cultura reproduzia o antraz em animais sadios e podia ser reisolada deles — os postulados que ainda definem um patógeno — e passou ao bacilo da tuberculose e ao vibrião do cólera. Alexander Fleming (1928) notou que um mofo que contaminava uma placa de estafilococos havia limpado uma zona à sua volta; a substância, a penicilina, foi purificada e mostrou-se capaz de curar infecções por Florey e Chain (1940–1941), e em menos de uma década estafilococos resistentes que carregavam uma enzima destruidora de penicilina já eram comuns nos hospitais — um aviso que o próprio Fleming deu em sua palestra do Nobel. ∎

Robert Koch, que provou que bactérias determinadas causam doenças determinadas e inventou os métodos de cultivá-las (Wellcome Collection, CC BY 4.0). À direita: Alexander Fleming em seu laboratório com placas do mofo cujo produto se tornou a penicilina (arquivo da Marinha dos EUA, domínio público).

12.5 Antibióticos e resistência

Definição 12.9 (Antibióticos)

Um antibiótico é uma molécula que mata bactérias ou detém seu crescimento em concentrações inofensivas ao hospedeiro, agindo sobre um alvo que o hospedeiro não tem ou tem de forma diferente — a toxicidade seletiva. Os alvos são poucos. A parede celular: os $\beta$ -lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos) imitam a D-Ala-D-Ala terminal do peptídeo do peptidoglicano e acilam as enzimas que fazem suas ligações cruzadas, de modo que a parede em crescimento fica fraca e a célula estoura sob seu próprio turgor; a vancomicina liga a própria D-Ala-D-Ala. O ribossomo, cuja forma bacteriana difere da eucarionte: os aminoglicosídeos (a subunidade pequena, causando leitura errada), as tetraciclinas (que bloqueiam a entrada do tRNA), os macrolídeos e o cloranfenicol (o túnel de saída e a peptidil-transferase da subunidade grande). A DNA-girase e a topoisomerase IV: as quinolonas. A RNA-polimerase: a rifampicina. A síntese de folato, que os animais não fazem: as sulfonamidas e a trimetoprima. A membrana: as polimixinas, um último recurso. A concentração inibitória mínima (CIM) é a menor concentração de um fármaco que impede o crescimento visível de uma linhagem; uma linhagem é chamada resistente quando sua CIM excede a concentração que o fármaco alcança no paciente.

Método 12.10 (Medir a suscetibilidade)

Dois testes. A diluição em caldo: inocule um número fixo de células (cerca de $5\times 10^{5}$ por mililitro) numa fileira de tubos ou poços com o antibiótico em passos de duas vezes, incube por uma noite e leia o primeiro poço limpo: aquela concentração é a CIM. A difusão em disco: espalhe a linhagem numa placa de ágar, ponha discos de papel carregados com quantidades conhecidas de vários antibióticos e incube; o fármaco se difunde para fora, com a concentração caindo com a distância, e o crescimento é inibido até o raio em que a concentração iguala a CIM, de modo que o diâmetro da zona limpa — lido em tabelas calibradas — dá a suscetibilidade a cada disco numa só placa. Os dois testes levam um dia; sequenciar o genoma em busca de genes e mutações de resistência conhecidos leva o mesmo dia e está começando a substituí-los.

Definição 12.11 (Resistência)

Uma bactéria resiste a um antibiótico por um de cinco meios. Ela destrói o fármaco: as $\beta$ -lactamases hidrolisam o anel $\beta$ -lactâmico, e as variantes de espectro estendido e as carbapenemases hoje destroem até os mais novos. Ela altera o alvo: uma mutação na proteína ribossômica ou na girase que o fármaco liga, ou, no MRSA (Staphylococcus aureus resistente à meticilina), um gene adquirido de uma enzima de ligação cruzada que os $\beta$ -lactâmicos não ligam; a resistência à vancomicina troca a D-Ala terminal por D-lactato, que o fármaco não reconhece. Ela bombeia o fármaco para fora com bombas de efluxo, muitas vezes de especificidade ampla. Ela impede o fármaco de entrar, perdendo uma porina. Ou ela contorna a etapa bloqueada com uma enzima alternativa. As mutações de alvo surgem ao acaso no paciente a taxas de $10^{-8}$ a $10^{-6}$ por divisão e são selecionadas durante o tratamento; as enzimas e as bombas são, em sua maioria, adquiridas em plasmídeos do vasto reservatório de bactérias do solo e do intestino, no qual evoluíram por eras contra os antibióticos que fungos e outras bactérias produzem. As persistentes — células dormentes que sobrevivem a um fármaco sem serem geneticamente resistentes — explicam as recaídas depois de tratamentos que deveriam ter funcionado.

Proposição 12.12 (Por que a resistência é inevitável e a combinação é a resposta)

Uma infecção de $10^{9}$ células tratada com um fármaco contra o qual mutações de resistência surgem a $10^{-8}$ por divisão já contém cerca de dez células resistentes; o fármaco mata as demais e as dez tomam conta — exatamente a aritmética do Capítulo 11, já que uma população bacteriana e um tumor são ambos clones em evolução sob seleção. Dois fármacos de alvos independentes enfrentam uma célula duplamente resistente a $10^{-16}$ por divisão, que um bilhão de células não contém. É por isso que a tuberculose, cujas lesões abrigam de $10^{8}$ a $10^{9}$ bacilos, é tratada com três ou quatro fármacos ao mesmo tempo desde os anos 1950, e por que a monoterapia dela produzia resistência em meses; é também por isso que todo uso de um antibiótico, num paciente ou num confinamento de gado, seleciona resistência em algum lugar, e por que o ritmo de antibióticos novos — nenhum de classe nova contra Gram-negativas desde os anos 1960 — é a medida contra a qual se contam as perdas. Os remédios são os de qualquer disputa evolutiva: usar menos, combinar, terminar o tratamento para que as células parcialmente resistentes não sobrevivam e se reproduzam, e achar alvos novos.

Exemplo 12.13 (A janela de seleção de mutantes)

Uma linhagem tem CIM de $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; seus mutantes resistentes de primeiro passo, presentes a um em $10^{7}$ , têm CIM de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ . Uma dose que mantenha o fármaco a $4\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ mata o tipo selvagem e deixa os mutantes crescerem sem concorrência: a faixa de concentração entre a CIM do tipo selvagem e a dos mutantes é a janela de seleção de mutantes, e um tratamento que se instale nela cria resistência. Uma dose acima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ mata os dois; uma dose baixa demais, ou um tratamento interrompido quando o paciente se sente melhor e o nível do fármaco está caindo pela janela, é como se fabrica uma população resistente. A mesma lógica fixa os esquemas de tratamento da tuberculose: seis meses, quatro fármacos, em doses acima da CIM de todo mutante de um passo.

A janela de seleção de mutantes. Um nível de fármaco acima da CIM dos mutantes mata tudo; entre as duas CIMs (área sombreada) ele mata o tipo selvagem e seleciona os mutantes. Uma dose cujo nível caia pela janela durante horas, ou um tratamento interrompido cedo, cria resistência.

Observação 12.14 (A maioria das bactérias não é patógena)

As bactérias da clínica deste capítulo são uma minoria ínfima. Do milhão estimado de espécies, algumas centenas causam doença humana; as demais tocam os ciclos do nitrogênio, do enxofre e do carbono (o volume do 2.º ano), fixam o nitrogênio de cada leguminosa, digerem a celulose de cada ruminante e compõem os microbiomas do Capítulo 14, cuja perda sob tratamento antibiótico é um custo de cada tratamento. Os próprios antibióticos são moléculas delas — armas e sinais evoluídos entre bactérias do solo e fungos muito antes de haver hospitais —, e assim são também a maior parte dos genes de resistência.

12.6 Exercícios

Exercício 12.1 ★

Descreva os envoltórios Gram-positivo e Gram-negativo e explique por que a coloração de Gram os distingue.

Solução

Solução de Exercício 12.1.

Gram-positiva: membrana citoplasmática envolvida por uma parede de peptidoglicano espessa, de muitas camadas, entremeada de ácidos teicoicos. Gram-negativa: uma camada fina de peptidoglicano num periplasma e, depois, uma membrana externa cuja monocamada externa é lipopolissacarídeo, com porinas. O complexo cristal violeta–iodo fica preso na parede espessa e desidratada pelo álcool da Gram-positiva (roxa), mas é lavado para fora da Gram-negativa por sua parede fina e sua membrana externa rompida, que então absorve a contracoloração rosa.

Exercício 12.2 ★

Uma cultura de $10^{3}$ células por mililitro chega a $10^{9}$ em $8\,\mathrm{h}$ de crescimento exponencial. Determine o número de gerações, o tempo de geração e $\mu$ .

Solução

Solução de Exercício 12.2.

$10^{6}$ vezes $= 2^{19.9}$ : cerca de $20$ gerações; $T = 8\,\mathrm{h}/20 = 24\,\mathrm{min}$ ; $\mu = \ln 2/0.4\,\mathrm{h} = 1.7\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Exercício 12.3 ★

Nomeie as três rotas da transferência horizontal de genes e dê o experimento clássico que demonstrou cada uma.

Solução

Solução de Exercício 12.3.

Transformação — Griffith (1928) e Avery, MacLeod e McCarty (1944): pneumococos virulentos mortos pelo calor transformam pneumococos vivos avirulentos, e o agente é o DNA. Transdução — Zinder e Lederberg (1952): o fago P22 leva genes de Salmonella de uma linhagem a outra através de um filtro que retém as células. Conjugação — Lederberg e Tatum (1946): duas linhagens auxotróficas de E. coli dão recombinantes prototróficos apenas quando misturadas, exigindo contato celular (o tubo em U de Davis).

Exercício 12.4 ★

Dê o alvo da penicilina, da estreptomicina, da ciprofloxacina e da rifampicina, e diga por que cada uma é seletivamente tóxica.

Solução

Solução de Exercício 12.4.

Penicilina: as transpeptidases que fazem as ligações cruzadas do peptidoglicano, que as células animais não têm. Estreptomicina: a subunidade ribossômica pequena, cuja forma bacteriana difere da eucarionte. Ciprofloxacina: a DNA-girase, uma topoisomerase bacteriana ausente nos humanos. Rifampicina: a subunidade $\beta$ da RNA-polimerase bacteriana, que a enzima eucarionte não compartilha.

Exercício 12.5 ★★

Um quimiostato tem $\mu_{\max} = 0.8\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $Y = 0.4$ . Calcule $S^{*}$ e $X^{*}$ em $D = 0.2$ , $0.6$ e $0.79$ h $^{-1}$ , e a taxa de diluição em que começa a lavagem.

Solução

Solução de Exercício 12.5.

$S^{*} = K_{S}D/(\mu_{\max} - D)$ , $X^{*} = Y(S_{0} - S^{*})$ . $D = 0.2$ : $S^{*} = 0.0067\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.80\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . $D = 0.6$ : $S^{*} = 0.06$ , $X^{*} = 0.78$ . $D = 0.79$ : $S^{*} = 1.58$ , $X^{*} = 0.17$ . Lavagem quando $D = \mu(S_{0}) = 0.8\times 2/2.02 = 0.79\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Exercício 12.6 ★★

Usando a Proposição 12.7, compare a densidade limiar da percepção de quórum no órgão de luz de uma lula ( $k = 0.01\,\mathrm{h}^{-1}$ ) e em água do mar corrente ( $k = 10\,\mathrm{h}^{-1}$ ), com $p = 100$ moléculas por célula por hora e $A_{\text{thr}} = 10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ( $6\times 10^{12}$ moléculas por litro).

Solução

Solução de Exercício 12.6.

$(N/V)_{\text{thr}} = kA_{\text{thr}}/p$ . Órgão de luz: $0.01\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{8}$ por litro $= 6\times 10^{5}$ por mL. Água do mar: $10\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{11}$ por litro $= 6\times 10^{8}$ por mL — mil vezes mais alta, nunca alcançada no mar.

Exercício 12.7 ★★

Uma placa de difusão em disco mostra zonas de $25$ , $12$ e $0\,\mathrm{mm}$ para três fármacos. Interprete cada uma e explique por que um diâmetro de zona pode ser convertido numa CIM.

Solução

Solução de Exercício 12.7.

$25\,\mathrm{mm}$ : sensível, CIM baixa. $12\,\mathrm{mm}$ : suscetibilidade reduzida, intermediária — pode falhar em doses comuns. $0\,\mathrm{mm}$ : resistente, com crescimento até o disco. O fármaco se difunde do disco de modo que sua concentração cai com a distância de forma reprodutível; o crescimento para onde a concentração iguala a CIM, de modo que o raio da zona e a CIM se relacionam por uma curva de calibração estabelecida com linhagens de CIM conhecida.

Exercício 12.8 ★★

Explique como um único evento de conjugação pode tornar uma Klebsiella sensível resistente a cinco antibióticos, e por que os genes de resistência são tantas vezes encontrados juntos em plasmídeos.

Solução

Solução de Exercício 12.8.

O plasmídeo conjugativo carrega um integron cuja série de cassetes contém vários genes de resistência, além de transpósons que carregam mais; o plasmídeo cruza num único acasalamento e expressa todos eles. Eles se agrupam porque a seleção por qualquer um dos fármacos mantém o plasmídeo inteiro, de modo que os genes que pegam carona nele persistem (cosseleção); os integrons capturam cassetes; os transpósons saltam para plasmídeos; e a unidade de transferência é o plasmídeo, e não o gene.

Exercício 12.9 ★★

Um paciente tem $10^{9}$ bactérias e toma um fármaco contra o qual a resistência surge a $10^{-7}$ por divisão. Calcule as células resistentes esperadas no início; depois, com dois fármacos independentes. Por que as persistentes são um problema diferente?

Solução

Solução de Exercício 12.9.

Só o fármaco: $10^{-7}\times 10^{9} = 100$ células resistentes esperadas. Dois fármacos independentes: $10^{-14}\times 10^{9} = 10^{-5}$ . As persistentes não são mutantes: uma pequena fração de células dormentes sobrevive a qualquer fármaco e volta a crescer numa população plenamente sensível quando o fármaco se vai, de modo que um segundo fármaco não ajuda; só ajuda um tratamento longo o bastante para apanhá-las quando despertam, ou um fármaco ativo em células dormentes.

Exercício 12.10 ★★★

Mostre que o estado estacionário do quimiostato é estável: perturbe $X$ ligeiramente acima de $X^{*}$ e acompanhe os sinais de $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t$ e $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t$ . Depois explique por que duas espécies que competem por um nutriente num quimiostato não podem coexistir no estado estacionário, e qual delas vence a um dado $D$ .

Solução

Solução de Exercício 12.10.

$X > X^{*}$ : o consumo $\mu X/Y$ excede o suprimento, e por isso $S$ cai abaixo de $S^{*}$ ; então $\mu(S) < D$ e $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t < 0$ , e $X$ volta a cair; à medida que $X$ cai, $S$ sobe de novo. Os dois desvios são corrigidos: o estado estacionário é estável. Duas espécies: cada uma precisa de $\mu_{i}(S) = D$ para persistir, o que fixa seu próprio $S_{i}^{*}$ ; o nutriente só pode assumir um valor, de modo que no máximo uma espécie persiste. Aquela de menor $S^{*}(D)$ leva $S$ abaixo do que a outra precisa, e a outra é lavada para fora; qual é essa espécie pode mudar com $D$ , se suas curvas de Monod se cruzarem.

Exercício 12.11 ★★★

O autoindutor induz sua própria sintase. Modifique o modelo da Proposição 12.7 de modo que $p$ salte de $p_{0}$ para $p_{1} \gg p_{0}$ quando $A > A_{\text{thr}}$ , e mostre que o sistema pode ter dois estados estáveis ao longo de uma faixa de densidades (histerese): uma população que já ligou continua ligada numa densidade em que uma população ingênua estaria desligada. Qual é a utilidade biológica disso?

Solução

Solução de Exercício 12.11.

Com a densidade $\rho = N/V$ , o estado desligado $A = p_{0}\rho/k$ existe enquanto se mantém abaixo de $A_{\text{thr}}$ , isto é, $\rho < kA_{\text{thr}}/p_{0}$ ; o estado ligado $A = p_{1}\rho/k$ existe enquanto se mantém acima, isto é, $\rho > kA_{\text{thr}}/p_{1}$ . Para $kA_{\text{thr}}/p_{1} < \rho < kA_{\text{thr}}/p_{0}$ os dois são autoconsistentes: uma população que já ligou se mantém ligada com sua produção maior, e uma que não ligou fica desligada. Utilidade: o compromisso — uma vez que uma colônia tenha decidido construir um biofilme ou liberar toxina, uma queda de densidade não desfaz a decisão, e o interruptor é abrupto e sincronizado, em vez de graduado.

Exercício 12.12 ★★★

Explique a janela de seleção de mutantes e use-a para argumentar a favor ou contra cada uma destas opções: (a) doses altas em tratamentos curtos; (b) doses baixas em tratamentos longos; (c) parar quando os sintomas cedem; (d) terapia combinada.

Solução

Solução de Exercício 12.12.

(a) Doses altas em tratamentos curtos: o nível fica acima da CIM dos mutantes e mata igualmente o tipo selvagem e os mutantes de primeiro passo — a favor, limitada pela toxicidade. (b) Doses baixas em tratamentos longos: o nível se instala na janela por dias e cria resistência — contra. (c) Parar quando os sintomas cedem: os sobreviventes são as células menos sensíveis, e o nível em queda passa pela janela — contra. (d) Combinação: uma célula precisa ser resistente aos dois, coisa que um bilhão de células não contém — a favor.

12.7 Problema: um quimiostato e uma clínica

Problema 12.1

Problema de fim de semana — uma cultura crescida num frasco e mantida num quimiostato, uma bactéria luminosa contada até seu quórum, e uma infecção tratada contra a aritmética da resistência, terminando nas células do quimiostato, na densidade em que a luz se acende e nas chances de um tratamento de dois fármacos encontrar uma célula resistente

Dados: E. coli a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $T = 20\,\mathrm{min}$ ; uma célula pesa $1\,\mathrm{pg}$ . Quimiostato: $V = 1\,\mathrm{L}$ , $F = 0.5\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glicose, $Y = 0.5$ . Vibrio: $p = 500$ moléculas de autoindutor por célula por hora, $A_{\text{thr}} = 6\times 10^{12}$ moléculas por litro ( $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k = 0.05\,\mathrm{h}^{-1}$ no órgão de luz. Infecção: $10^{9}$ células; resistência ao fármaco A a $10^{-8}$ por divisão, ao fármaco B a $10^{-7}$ ; CIM do tipo selvagem para A $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , mutante de primeiro passo $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; uma dose dá $16\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , caindo com meia-vida de $4\,\mathrm{h}$ .

Parte I — O frasco.

Uma célula em $100\,\mathrm{mL}$ de caldo. Quantas células depois de $6\,\mathrm{h}$ de crescimento exponencial, e que densidade por mL?
O caldo sustenta no máximo $2\times 10^{9}$ células por mL. Quando o crescimento para, e qual é a massa de células da cultura?
Quanto tempo os descendentes de uma célula levariam para alcançar a massa da Terra ( $6\times 10^{27}$ g)? Comente.
A fase de latência dura $1\,\mathrm{h}$ quando células da fase estacionária são inoculadas em meio fresco, e quase nada quando se usam células em fase exponencial. Explique.
Calcule $\mu$ a partir de $T$ . Se o meio for trocado por um açúcar em que $T = 60\,\mathrm{min}$ , qual é $\mu$ , e por qual fator cai o número de células depois de $6\,\mathrm{h}$ ?
Uma amostra da cultura estacionária é espalhada numa placa e dá $200$ colônias a partir de $0.1\,\mathrm{mL}$ de uma diluição $10^{-6}$ . Qual é a contagem de viáveis, e por que ela pode diferir de uma contagem ao microscópio?

Parte II — O quimiostato.

Calcule a taxa de diluição $D$ e o tempo de geração que a cultura é forçada a adotar.
Calcule $S^{*}$ e $X^{*}$ (em g/L e em células por mL).
Quantas células deixam o recipiente por hora? Por quantas gerações a cultura passa num mês?
A bomba é acelerada para $F = 0.95\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ . Novos $S^{*}$ e $X^{*}$ ? O que acontece em $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ ?
Surge um mutante com $\mu_{\max} = 1.2\,\mathrm{h}^{-1}$ e o mesmo $K_{S}$ . Em $D = 0.5$ , de que $S^{*}$ ele precisa, e o que acontece com a linhagem original? (Use o Exercício 12.10.)
Um mês de operação são $700$ gerações. Se uma mutação benéfica surge a $10^{-9}$ por divisão e o recipiente abriga $10^{12}$ células, quantas mutações benéficas surgem por geração? O que isso diz sobre a evolução num quimiostato?

Parte III — O quórum.

Calcule a densidade celular limiar para a luz no órgão de luz, em células por mL.
O órgão de luz contém $1\,\text{µ}\mathrm{L}$ de bactérias a $10^{10}$ por mL. Por qual fator o autoindutor está acima do limiar?
Na água do mar o sinal é levado embora com $k = 20\,\mathrm{h}^{-1}$ . Densidade limiar? Compare com as $10^{2}$ células por mL do mar aberto.
Depois que a lula expele $90\,\%$ das bactérias ao amanhecer, quanto tempo até que as $10^{9}$ por mL restantes, dividindo-se a cada $2\,\mathrm{h}$ , restaurem $10^{10}$ por mL? A luz se apaga nesse meio-tempo?
Cada célula que brilha gasta cerca de $20\,\%$ de sua energia com luz. Por que uma célula escura é favorecida no mar, e não no órgão?
Um patógeno usa o mesmo sistema para adiar suas toxinas até estar numeroso. Proponha uma estratégia de fármaco que explore isso e diga por que ela poderia selecionar resistência mais devagar que um antibiótico.

Parte IV — A clínica.

Número esperado de células resistentes a A no início do tratamento; a B; aos dois.
Probabilidade de não existir célula resistente a A; e aos dois.
Depois da dose, quando o nível do fármaco cai a $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ e a $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ? Quanto tempo por dose ele passa na janela de seleção de mutantes?
Se o fármaco for dado a cada $12\,\mathrm{h}$ , que fração do tempo o nível está na janela, e o que isso prevê ao longo de um tratamento de dez dias só com A?
Sugira uma mudança de posologia que mantenha o nível acima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ o tempo todo (calcule o intervalo ou a dose necessária) e enuncie seu custo.
Uma célula em $10^{4}$ é persistente, dormente e intocada por qualquer concentração dos dois fármacos. Quantas sobrevivem ao tratamento, o que acontece quando o fármaco é retirado, e o que isso implica para a duração do tratamento?
Resuma: as células por mL no quimiostato (questão 8), a densidade limiar da luz (questão 13) e a probabilidade de o tratamento com dois fármacos não encontrar célula resistente alguma (questão 20).

Solução

Solução de Problema 12.1.

1. $18$ gerações: $2^{18} = 2.6\times 10^{5}$ células, $2.6\times 10^{3}$ por mL. 2. $2\times 10^{9}\times 100 = 2\times 10^{11}$ células $= 2^{37.5}$ : depois de $12.5\,\mathrm{h}$ ; massa $0.2\,\mathrm{g}$ . 3. $6\times 10^{27}/10^{-12} = 6\times 10^{39} = 2^{132}$ células: $132$ gerações, $44\,\mathrm{h}$ . Os nutrientes, o oxigênio e os resíduos o detêm em menos de um dia; o crescimento exponencial é sempre breve. 4. As células estacionárias desmontaram seus ribossomos e reprimiram suas enzimas metabólicas; precisam reconstruí-los antes de se dividir. As células exponenciais chegam plenamente equipadas. 5. $\mu = \ln 2/0.333\,\mathrm{h} = 2.08\,\mathrm{h}^{-1}$ ; com $T = 60\,\mathrm{min}$ , $0.69\,\mathrm{h}^{-1}$ ; depois de $6\,\mathrm{h}$ , $2^{6} = 64$ em vez de $2^{18}$ : um fator $2^{12} \approx 4000$ a menos. 6. $200/(0.1\times 10^{-6}) = 2\times 10^{9}$ células viáveis por mL. O microscópio também conta células mortas e células que não crescerão na placa, e um aglomerado dá uma única colônia. 7. $D = 0.5/1 = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $T = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h} = 83\,\mathrm{min}$ . 8. $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; $X^{*} = 0.5\times 1.99 \approx 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 10^{12}$ células por litro, $10^{9}$ por mL. 9. $0.5\times 10^{12} = 5\times 10^{11}$ células por hora; $720/1.39 \approx 520$ gerações por mês. 10. $D = 0.95$ : $S^{*} = 0.01\times 0.95/0.05 = 0.19\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.5\times 1.81 = 0.9\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . Em $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $D > \mu_{\max}$ : lavagem. 11. O mutante mantém $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.7 = 0.0071\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; nessa glicose a linhagem original cresce a $1.0\times 0.0071/0.0171 = 0.42\,\mathrm{h}^{-1} < D$ e declina como $e^{-0.08t}$ : é lavada para fora ao longo de algumas semanas. O mutante toma conta. 12. $10^{-9}\times 10^{12} = 1000$ mutações benéficas por geração: a adaptação é contínua, com um clone vantajoso novo varrendo a população a cada poucas centenas de gerações — o quimiostato é uma máquina de evolução. 13. $kA_{\text{thr}}/p = 0.05\times 6\times 10^{12}/500 = 6\times 10^{8}$ por litro $= 6\times 10^{5}$ células por mL. 14. $10^{10}/6\times 10^{5} \approx 1.7\times 10^{4}$ vezes. 15. $20\times 6\times 10^{12}/500 = 2.4\times 10^{11}$ por litro, $2.4\times 10^{8}$ por mL — seis ordens de grandeza acima das $10^{2}$ por mL do mar: escuro. 16. Dez vezes são $3.3$ duplicações, $6.6\,\mathrm{h}$ . Com $10^{9}$ por mL a população ainda está $1700$ vezes acima do limiar: a luz continua acesa. 17. No mar ninguém vê a luz e ela não alimenta hospedeiro algum: um mutante escuro poupa $20\,\%$ e supera os que brilham. No órgão, a lula seleciona a favor da luz — ela expele ou deixa de alimentar os trapaceiros escuros —, de modo que o custo compra uma casa. 18. Bloqueie o receptor ou destrua o autoindutor (a extinção do quórum): as bactérias vivem, mas nunca acionam suas toxinas, e o sistema imune as elimina. Como bactérias sensíveis e “resistentes” crescem igualmente — nada é morto —, a vantagem seletiva de escapar do fármaco é pequena, e a resistência deveria se espalhar mais devagar que a um fármaco que mata. 19. A: $10^{-8}\times 10^{9} = 10$ ; B: $100$ ; aos dois: $10^{-15}\times 10^{9} = 10^{-6}$ . 20. $P_{0}(\text{A}) = e^{-10} = 5\times 10^{-5}$ ; $P_{0}(\text{ambos}) = e^{-10^{-6}} = 0.999999$ . 21. $16 \to 8$ : uma meia-vida, $4\,\mathrm{h}$ ; $16 \to 1$ : quatro, $16\,\mathrm{h}$ ; na janela das $4\,\mathrm{h}$ às $16\,\mathrm{h}$ , $12\,\mathrm{h}$ por dose. 22. Com doses a cada $12\,\mathrm{h}$ : na janela da hora $4$ à hora $12$ , dois terços do tempo; ao longo de dez dias os mutantes de primeiro passo de A — dez deles no início — são selecionados e A sozinho falha. 23. Acima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ o tempo todo: dose a cada meia-vida ( $4\,\mathrm{h}$ ), ou uma dose com pico de $64\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ a cada $12\,\mathrm{h}$ ( $64 \to 8$ em três meias-vidas), ou uma infusão contínua. Custos: a toxicidade dos picos altos, ou seis doses por dia que os pacientes não vão cumprir. 24. $10^{-4}\times 10^{9} = 10^{5}$ persistentes sobrevivem sejam quais forem os fármacos; quando o tratamento para, elas despertam e regeneram uma população plenamente sensível — uma recaída. O tratamento precisa durar o bastante para apanhá-las quando saem da dormência, e é por isso que a tuberculose leva seis meses. 25. $10^{9}$ células por mL no quimiostato; a luz se acende em $6\times 10^{5}$ células por mL; $P_{0} = 0.999999$ de que o tratamento com dois fármacos não encontre célula resistente alguma.

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