Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

1Cromatina e epigenética

Dois camundongos da mesma ninhada, geneticamente idênticos até a última base, estão lado a lado: um é magro e pardo, o outro é gordo e amarelo, e ficará diabético. Uma gata de pelagem tricolor exibe manchas alaranjadas e pretas embora cada célula de sua pele carregue os mesmos dois cromossomos X. Uma criança herda o mesmo trecho deletado do cromossomo 15 que outra criança, e uma tem a síndrome de Prader–Willi enquanto a outra tem a síndrome de Angelman — a diferença está apenas em de qual dos pais veio a deleção. Nada disso está escrito na sequência do DNA. Está escrito sobre ela: no modo como dois metros de DNA são acondicionados num núcleo de dez micrômetros, nos pequenos grupos químicos ligados às proteínas de empacotamento e às próprias citosinas, e na maquinaria que copia essas marcas de uma célula para suas filhas. Este capítulo trata dessa segunda camada de informação, de seus portadores moleculares e dos limites honestos daquilo que ela consegue lembrar.

1.1 Cromatina: o DNA num carretel

Definição 1.1 (Nucleossomo e cromatina)

A cromatina é o complexo do DNA com proteínas sob a forma do qual o genoma existe num núcleo eucarionte. Sua unidade de repetição é o nucleossomo: $147\,\mathrm{bp}$ de DNA enrolados em $1.65$ voltas levógiras em torno de um octâmero de histonas — duas cópias de cada uma das proteínas pequenas e muito básicas H2A, H2B, H3 e H4 — seguidos de um ligante de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$ até o nucleossomo seguinte. Uma quinta histona, a H1, liga-se ao ligante onde ele entra e sai do cerne e ajuda as contas a se empacotarem umas contra as outras. Cada histona do cerne tem uma cauda amino-terminal não estruturada, de umas $20\text{ a }40$ resíduos, que se projeta para fora da partícula. A cromatina que se cora fracamente, é frouxamente empacotada e é transcrita é a eucromatina; a cromatina densamente empacotada, de replicação tardia e em larga medida silenciosa, nos centrômeros, nos telômeros e nas sequências repetidas, é a heterocromatina.

Evidência. Hewish e Burgoyne (1973) digeriram núcleos de fígado de rato com uma nuclease endógena e constataram que o DNA saía não como um rastro contínuo, mas como uma escada de fragmentos cujos comprimentos eram múltiplos de cerca de $200\,\mathrm{bp}$ : o DNA estava protegido em intervalos regulares e era cortado apenas entre eles. Kornberg (1974) mostrou que a unidade protegida era uma partícula de oito histonas com cerca de $200\,\mathrm{bp}$ , e micrografias eletrônicas de cromatina delicadamente espalhada mostraram as “contas num colar”. Luger e colaboradores (1997) resolveram a estrutura cristalográfica da partícula do cerne a $2.8\,\text{Å}$ : $147\,\mathrm{bp}$ , um octâmero com as caudas passando por entre os giros do DNA. ∎

A fibra de 10\, nm: cernes de nucleossomo (azul) sobre um DNA contínuo (vermelho), cada conta um octâmero de histonas com suas caudas (laranja) projetadas para fora, a histona ligante H1 (verde) no ponto de entrada e saída. Cerca de seis nucleossomos ocupam o comprimento que 1200\, bp de DNA nu ocupariam. — A fibra de $10\,\mathrm{nm}$ : cernes de nucleossomo (azul) sobre um DNA contínuo (vermelho), cada conta um octâmero de histonas com suas caudas (laranja) projetadas para fora, a histona ligante H1 (verde) no ponto de entrada e saída. Cerca de seis nucleossomos ocupam o comprimento que $1200\,\mathrm{bp}$ de DNA nu ocupariam.

A cromatina na escala molecular: a dupla-hélice enrolada em torno de cernes sucessivos de histonas, as “contas num colar” que a escada da nuclease revelou.

Proposição 1.2 (Níveis de compactação)

A razão de empacotamento de uma estrutura de cromatina é o comprimento do DNA que ela contém dividido pelo comprimento da estrutura. O enrolamento na fibra de $10\,\mathrm{nm}$ dá uma razão de cerca de $6$ : os $68\,\mathrm{nm}$ de uma repetição de $200\,\mathrm{bp}$ são comprimidos numa única conta de $11\,\mathrm{nm}$ . No núcleo interfásico a fibra não se enrola numa fibra regular mais grossa, como os livros por muito tempo a desenharam, mas se dobra em alças de dezenas a centenas de quilobases mantidas em suas bases por complexos de coesina em forma de anel e pela proteína ligadora de DNA CTCF; as alças se agrupam em domínios de associação topológica (TADs) de cerca de uma megabase, dentro dos quais um gene encontra seus reguladores muito mais vezes do que encontra qualquer coisa de fora. Um cromossomo mitótico, o estado mais compacto, tem uma razão de empacotamento próxima de $10\,000$ : os $4\,\mathrm{cm}$ de DNA de um cromossomo humano médio são dobrados num bastão de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ de comprimento.

Exemplo 1.3 (Dois metros em dez micrômetros)

Um núcleo diploide humano contém $6.4\times 10^{9}$ pares de bases. A $0.34\,\mathrm{nm}$ por par de bases isso dá $2.2\,\mathrm{m}$ de dupla-hélice, num núcleo de cerca de $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diâmetro. Tudo isso é acondicionado em $6.4\times 10^{9}/200 \approx 3.2\times 10^{7}$ nucleossomos, cada um carregando cerca de $108\,\mathrm{kDa}$ de histonas contra $96\,\mathrm{kDa}$ de DNA ( $147\,\mathrm{bp}$ a $650\,\mathrm{Da}$ por par): o núcleo contém, em massa, aproximadamente tanta histona quanto DNA. O próprio DNA, tratado como um cilindro de $2\,\mathrm{nm}$ de diâmetro, tem um volume de apenas cerca de $7\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , uns $1\,\%$ de um núcleo esférico de raio $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; o problema do empacotamento é de emaranhamento e de acesso, não de espaço.

1.2 O código das histonas

Definição 1.4 (Modificações das histonas)

Os resíduos das caudas das histonas sofrem modificações covalentes: acetilação de lisinas (que neutraliza sua carga positiva e afrouxa o aperto sobre o DNA), metilação de lisinas e argininas (um, dois ou três grupos metila, sem mudança de carga), fosforilação de serinas, ubiquitinação de lisinas. Uma modificação é nomeada pela histona, pelo resíduo e pelo grupo: H3K4me3 é a histona H3, lisina 4, trimetilada; H3K27ac é a H3 com a lisina 27 acetilada. O código das histonas é a correlação entre combinações de marcas e o estado do gene subjacente: H3K4me3 e H3K27ac em promotores e intensificadores ativos, H3K36me3 ao longo dos corpos dos genes transcritos, H3K9me3 na heterocromatina constitutiva, H3K27me3 em genes silenciados durante o desenvolvimento. As enzimas que acrescentam uma marca são escritores (acetiltransferases de histonas, HATs; metiltransferases), as que a removem são apagadores (desacetilases de histonas, HDACs; desmetilases), e as proteínas que se ligam a uma marca e agem sobre ela são leitores: um bromodomínio liga acetil-lisina, um cromodomínio metil-lisina.

Proposição 1.5 (As marcas são lidas, não apenas sentidas)

A acetilação age em parte por eletrostática — uma cauda acetilada segura seu DNA com menos força e a fibra se abre — mas a maioria das marcas age recrutando leitores. A H3K9me3 é ligada pelo cromodomínio da proteína de heterocromatina HP1, que dimeriza, faz ponte entre nucleossomos vizinhos e recruta a própria metiltransferase (SUV39H) que escreve H3K9me3 no nucleossomo seguinte: a marca se propaga ao longo da fibra até encontrar uma fronteira, e compacta o que cobre. A H3K27me3 é escrita pelo complexo repressor Polycomb 2 (PRC2, subunidade catalítica EZH2), lida pelo PRC1, que ubiquitina a H2A e compacta a fibra, e o complexo é ele próprio estimulado pela marca que produz; o grupo de proteínas Trithorax escreve a H3K4me3 oposta e mantém ligados os genes do desenvolvimento de um dado tipo celular. Cada uma dessas alças — o leitor recruta o escritor — é uma retroalimentação positiva que permite a um estado manter-se depois de estabelecido, que é do que uma marca hereditária precisa.

A lógica escritor–leitor–apagador. Um leitor ligado a uma marca num nucleossomo recruta o escritor que põe a mesma marca no seguinte, de modo que o estado se propaga e se copia; os apagadores se opõem a isso. Os grupos acetila (verde) abrem a fibra; a H3K9me3 (vermelho) a fecha.

Método 1.6 (Imunoprecipitação da cromatina (ChIP))

Para mapear onde uma marca ou uma proteína se assenta no genoma: (1) faça a ligação cruzada das proteínas ao DNA em células vivas com formaldeído; (2) fragmente a cromatina em pedaços de algumas centenas de pares de bases; (3) precipite os fragmentos com um anticorpo contra a marca (digamos H3K27me3) preso a esferas; (4) desfaça as ligações cruzadas e purifique o DNA; (5) sequencie-o (ChIP-seq) e conte as leituras ao longo do genoma: os picos são os lugares onde a marca estava. Um controle de DNA de entrada sem anticorpo fixa o ruído de fundo. A resolução é a dos fragmentos, cerca de um nucleossomo.

Observação 1.7 (Código ou correlação)

A palavra “código” exagera o caso. Muitas marcas são consequências da transcrição, e não causas dela (a H3K36me3 é depositada por uma metiltransferase que viaja com a polimerase), e retirar um escritor muitas vezes muda a expressão bem menos do que a distribuição da marca sugere. O que está bem estabelecido é que algumas poucas marcas — H3K9me3, H3K27me3 e a metilação do DNA, adiante — carregam um silenciamento autopropagante que sobrevive ao sinal que o instaurou.

1.3 A metilação do DNA e a cópia de uma marca

Definição 1.8 (Metilação do DNA)

Nos vertebrados um grupo metila é acrescentado ao carbono 5 da citosina quase somente no dinucleotídeo CpG (um C seguido de um G na mesma fita), uma sequência que é seu próprio complemento, de modo que um CpG metilado costuma estar metilado nas duas fitas. Cerca de $70\text{ a }80\,\%$ dos CpGs de uma célula humana estão metilados, e promotores metilados são silenciosos: os grupos metila são lidos por proteínas ligadoras de metil-CpG (MeCP2, MBD1–4) que recrutam HDACs e metilases da H3K9, e bloqueiam diretamente vários fatores de transcrição. As exceções são as ilhas CpG, trechos de cerca de uma quilobase, ricos em G e C e em CpG, que se situam nos promotores da maioria dos genes de manutenção e permanecem não metilados em células normais. O grupo metila é escrito pelas DNA metiltransferases: a DNMT3A e a DNMT3B realizam a metilação de novo de sítios não metilados, e a DNMT1, que prefere um CpG hemimetilado — uma fita metilada, a outra não —, realiza a metilação de manutenção atrás da forquilha de replicação. A remoção é passiva, por replicação sem manutenção, ou ativa, pelas enzimas TET, que oxidam a 5-metilcitosina a 5-hidroximetilcitosina e além, até que o reparo por excisão de bases a troque por uma citosina comum.

Exemplo 1.9 (Por que o genoma é pobre em CpG)

O genoma humano tem $42\,\%$ de G $+$ C, de modo que, se as bases fossem independentes, um CpG ocorreria com a frequência $0.21\times 0.21 \approx 0.044$ , cerca de $2.8\times 10^{8}$ vezes no genoma diploide. O número observado é de cerca de $5.6\times 10^{7}$ , um quinto disso. A razão é a própria marca: uma citosina metilada que perde seu grupo amino torna-se timina, uma base normal que o reparo não consegue reconhecer como errada, ao passo que uma citosina não metilada se desamina a uracila, que é excisada. Ao longo do tempo evolutivo os CpGs metilados mutaram em TpG e CpA, e só as ilhas não metiladas conservaram seus CpGs. A marca deixou sua assinatura na sequência.

Teorema 1.10 (Manutenção de um estado de metilação ao longo das divisões)

Considere um único sítio CpG, acompanhado ao longo de uma linhagem de células. A cada divisão a citosina da fita nova é metilada com probabilidade $\mu$ se a citosina da fita-molde está metilada (eficiência de manutenção) e com probabilidade $\delta$ se não está (taxa de novo). Seja $p_{n}$ a probabilidade de o sítio estar metilado após $n$ divisões. Então

p_{n+1} = \mu\, p_{n} + \delta\,(1 - p_{n}), \qquad p_{n} = p^{*} + (p_{0} - p^{*})\,(\mu - \delta)^{n}, \qquad p^{*} = \frac{\delta}{1 - \mu + \delta}.

Todo sítio deriva rumo ao mesmo equilíbrio $p^{*}$ , qualquer que seja seu estado inicial, e a memória do estado inicial decai geometricamente com razão $\mu - \delta$ . Uma marca é lembrada durante cerca de $1/(1 - \mu + \delta)$ divisões; a memória fiel de uma diferença entre sítios exige, portanto, um $\mu$ muito próximo de $1$ e um $\delta$ muito próximo de $0$ , ou uma retroalimentação que faça $\mu$ e $\delta$ dependerem do estado da vizinhança.

Demonstração. A recorrência é a lei da probabilidade total sobre os dois estados da fita-molde. Seu ponto fixo resolve $p^{*} = \mu p^{*} + \delta(1 - p^{*})$ , o que dá $p^{*}(1 - \mu + \delta) = \delta$ . Subtraindo a equação do ponto fixo da recorrência, $p_{n+1} - p^{*} = (\mu - \delta)(p_{n} - p^{*})$ , que iterada dá a forma fechada. Como $0 \le \delta \le \mu \le 1$ , a razão $\mu - \delta$ está em $[0,1]$ e o desvio encolhe; ele cai pela metade a cada $\ln 2 / (-\ln(\mu - \delta)) \approx \ln 2/(1 - \mu + \delta)$ divisões quando $\mu - \delta$ está perto de $1$ . ∎

Exemplo 1.11 (Números)

Os valores medidos em células de mamífero são $\mu \approx 0.99$ e $\delta \approx 0.02$ por divisão num CpG típico. Então $p^{*} = 0.02/0.03 \approx 0.67$ , próximo da fração metilada de todo o genoma, e $\mu - \delta = 0.97$ : um sítio totalmente metilado entregue apenas à maquinaria estaria a meio caminho de volta à média após $\ln 2 / 0.03 \approx 23$ divisões. Um promotor silenciado que permanece silencioso durante as centenas de divisões de uma vida precisa, portanto, de mais do que a DNMT1: os leitores de metil-CpG recrutam a metilação da H3K9 e os leitores da H3K9 recrutam a DNMT3, de modo que uma ilha densa de marcas eleva seu próprio $\mu$ rumo a $1$ e abaixa o $\delta$ vizinho rumo a $0$ . Inversamente, uma célula que perde a DNMT1 perde a marca passivamente: com $\mu = \delta = 0$ a fração de fitas metiladas cai pela metade a cada divisão.

À esquerda: a metilação de manutenção. Após a replicação todo CpG está hemimetilado; a DNMT1 copia a marca para a fita nova com probabilidade por sítio. À direita: o destino de um sítio ao longo das divisões para = 0.99, = 0.02 (azul a partir do estado metilado, vermelho a partir do não metilado) — ambos convergem para p* = 0.67 — e para um sítio cuja retroalimentação de vizinhança eleva a 0.999 (verde). — À esquerda: a metilação de manutenção. Após a replicação todo CpG está hemimetilado; a DNMT1 copia a marca para a fita nova com probabilidade $\mu$ por sítio. À direita: o destino de um sítio ao longo das divisões para $\mu = 0.99$ , $\delta = 0.02$ (azul a partir do estado metilado, vermelho a partir do não metilado) — ambos convergem para $p^{*} = 0.67$ — e para um sítio cuja retroalimentação de vizinhança eleva $\mu$ a $0.999$ (verde).

Método 1.12 (Ler a metilação: sequenciamento por bissulfito)

O sequenciamento sozinho não enxerga um grupo metila. Trate o DNA desnaturado com bissulfito de sódio: a citosina não metilada é desaminada a uracila, que é lida como T depois da PCR, ao passo que a 5-metilcitosina fica protegida e continua sendo lida como C. Sequencie o DNA convertido e compare-o com a referência: todo C que continuou C estava metilado, todo C que virou T não estava. Feito para todo o genoma (sequenciamento por bissulfito do genoma inteiro), isso dá o estado de metilação de cada um dos $2.8\times 10^{7}$ CpGs de um genoma haploide com resolução de uma base, como fração das células da amostra.

1.4 Inativação do X e imprinting genômico

Definição 1.13 (Inativação do cromossomo X)

Nas fêmeas de mamífero um dos dois cromossomos X de cada célula somática é silenciado transcricionalmente cedo no desenvolvimento, uma forma de compensação de dose que iguala a expressão dos genes ligados ao X entre fêmeas XX e machos XY. O cromossomo silenciado é compactado num corpo denso encostado no envoltório nuclear, o corpúsculo de Barr. A escolha de qual X silenciar é aleatória no embrião propriamente dito e, uma vez feita, é herdada clonalmente por todos os descendentes da célula. A inativação é iniciada pelo Xist, um RNA não codificante de $17\,\mathrm{kb}$ transcrito a partir do centro de inativação do X do cromossomo que será silenciado: ele recobre esse cromossomo em cis, recruta o Polycomb (H3K27me3), a variante de histona macroH2A e, por fim, a metilação do DNA dos promotores, e daí em diante o silêncio é mantido sem que o Xist seja necessário a cada divisão. Cerca de $15\,\%$ dos genes humanos ligados ao X escapam da inativação, em parte ou por inteiro.

Evidência. Barr e Bertram (1949) notaram um corpo denso nos núcleos de neurônios de gatas, mas não de gatos. Ohno (1959) mostrou que ele era um cromossomo X inteiro, condensado. Lyon (1961) juntou as peças: as fêmeas de camundongo heterozigóticas para genes de cor de pelagem ligados ao X têm uma pelagem em mosaico, com manchas que expressam um alelo ou o outro, de modo que cada mancha é um clone no qual um X, sempre o mesmo, está silencioso; o mesmo vale para as manchas alaranjadas e pretas de uma gata tartaruga ou tricolor, cujo gene alaranjado é ligado ao X, e para as glândulas sudoríparas em mosaico das mulheres portadoras de um alelo mutante de um gene ligado ao X. Um gato tricolor macho é quase sempre XXY. ∎

À esquerda: um núcleo feminino corado para DNA, com o X inativo compacto — o corpúsculo de Barr — comprimido contra a borda nuclear. À direita: uma gata tricolor. Cada mancha alaranjada ou preta é um clone de células da pele que silenciaram o mesmo cromossomo X; o branco é um gene de manchamento à parte, autossômico.

Definição 1.14 (Imprinting genômico)

Um gene está sob imprinting quando apenas um de seus dois alelos é expresso, e qual deles depende do genitor de que veio: alguns genes são expressos só a partir da cópia paterna, outros só a partir da materna. Os mamíferos têm uns $100\text{ a }200$ genes sob imprinting, agrupados, cada agrupamento governado por uma região controladora do imprinting (ICR) que está metilada num dos alelos parentais e não no outro. A metilação é fixada na linhagem germinativa — um padrão nos espermatozoides, outro nos óvulos —, apagada nas células germinativas da geração seguinte e fixada de novo conforme o sexo daquele indivíduo. Uma criança que recebe as duas cópias de um cromossomo do mesmo genitor (dissomia uniparental) tem, portanto, a dose errada dos genes sob imprinting nele, embora sua sequência seja inteiramente normal.

Evidência. McGrath e Solter e, independentemente, Surani, Barton e Norris (1984) produziram zigotos de camundongo com dois pronúcleos maternos, ou dois paternos, transferindo pronúcleos entre óvulos fecundados. Nenhum dos dois tipos chegou a termo, embora cada um tivesse dois conjuntos completos de cromossomos: os embriões ginogenéticos formavam um embrião razoável com uma placenta ruim, e os androgenéticos, uma placenta grande e quase nenhum embrião. Os dois genomas parentais não são equivalentes e ambos são necessários. Cattanach e Kirk (1985) mostraram, com dissomias uniparentais específicas de cromossomo, que a não equivalência se restringe a regiões particulares de cromossomos particulares, que são onde os agrupamentos sob imprinting foram encontrados mais tarde. ∎

Exemplo 1.15 (O agrupamento Igf2–H19)

O Igf2, um fator de crescimento fetal, é expresso a partir do alelo paterno; seu vizinho H19, um RNA não codificante, a partir do materno. Entre os dois está a ICR e, depois do H19, um conjunto compartilhado de intensificadores. No cromossomo materno a ICR está não metilada e liga o CTCF, que age como isolante: os intensificadores conseguem alcançar o H19, mas não o Igf2. No cromossomo paterno a ICR está metilada (fixada no espermatozoide), o CTCF não consegue se ligar, e os intensificadores alcançam o Igf2; a metilação também se propaga e silencia o promotor do H19. Uma marca, fixada numa linhagem germinativa, decide os dois genes.

O imprinting em Igf2–H19. Alelo materno: a ICR não metilada liga o CTCF, um isolante, de modo que os intensificadores a jusante ativam apenas o H19. Alelo paterno: a ICR foi metilada no espermatozoide, o CTCF não consegue se ligar, os intensificadores alcançam o Igf2, e a metilação silencia o H19. — O imprinting em *Igf2*–*H19*. Alelo materno: a ICR não metilada liga o CTCF, um isolante, de modo que os intensificadores a jusante ativam apenas o *H19*. Alelo paterno: a ICR foi metilada no espermatozoide, o CTCF não consegue se ligar, os intensificadores alcançam o *Igf2*, e a metilação silencia o *H19*.

Exemplo 1.16 (Prader–Willi e Angelman)

A mesma deleção de cerca de $5\,\mathrm{Mb}$ no cromossomo 15 (região 15q11–q13) causa a síndrome de Prader–Willi — tônus muscular fraco ao nascer, depois apetite insaciável e obesidade — quando está no cromossomo paterno, e a síndrome de Angelman — deficiência intelectual grave, ausência de fala, um temperamento alegre e convulsões — quando está no materno. A região carrega genes de expressão paterna (o SNRPN e um agrupamento de RNAs pequenos), cuja única cópia ativa se perde no primeiro caso, e o UBE3A, de expressão materna, perdido no segundo. A dissomia uniparental materna do 15, sem deleção alguma, também dá Prader–Willi: duas cópias maternas, silenciosas para os genes paternos.

Observação 1.17 (Por que fazer imprinting)

Os genes sob imprinting são enriquecidos no controle do crescimento fetal e da transferência placentária de nutrientes, com os genes de expressão paterna (Igf2, Peg3) tendendo a promover o crescimento e os de expressão materna (H19, Igf2r, Cdkn1c) a contê-lo. A teoria do parentesco lê nisso um conflito: os genes de um pai ganham em extrair mais de uma mãe que poderá carregar depois a prole de outros machos, ao passo que os genes da mãe ganham em racionar entre todas as suas ninhadas. O imprinting ocorre nos mamíferos placentários e nas plantas com flor, cujo endosperma também é alimentado pela mãe, e não em aves ou répteis, que é o que a teoria prevê.

1.5 A herança epigenética e seus limites

Definição 1.18 (Epigenética)

A epigenética é o estudo das mudanças hereditárias na atividade dos genes que não são mudanças na sequência do DNA: estados carregados pela metilação do DNA, pelas marcas das histonas ou por circuitos autossustentados de fatores de transcrição, e copiados através da divisão celular. Dois alelos de sequência idêntica, mas com estado epigenético estável diferente, são epialelos. A herança através da mitose é a regra e é o que faz uma célula diferenciada continuar diferenciada. A herança através da meiose, de genitor para descendente, é a exceção nos mamíferos, porque as marcas são apagadas em duas ondas de reprogramação: nas células germinativas primordiais, onde os imprintings e a maior parte da metilação são varridos e depois fixados de novo conforme o sexo, e outra vez no zigoto e no embrião inicial, onde o genoma paterno é ativamente desmetilado pela TET3 e o materno passivamente, antes que os padrões próprios do embrião sejam estabelecidos pelas DNMT3.

Exemplo 1.19 (O camundongo agouti viável amarelo)

No alelo $A^{vy}$ um retrotranspóson se inseriu a montante do gene de cor de pelagem agouti. Onde o promotor do transpóson está não metilado, ele aciona o agouti constantemente em todas as células; o camundongo é amarelo, obeso e propenso ao diabetes. Onde está metilado, o gene segue seu controle normal e o camundongo é pardo (“pseudoagouti”). Irmãos de ninhada geneticamente idênticos se distribuem por todo o espectro, e uma mãe amarela tem mais filhotes amarelos do que uma parda: o epialelo é apagado de forma incompleta através da linhagem germinativa materna. Waterland e Jirtle (2003) alimentaram mães $A^{vy}$ prenhes com uma dieta rica em doadores de metila (folato, vitamina B₁₂, colina, betaína) e deslocaram a pelagem dos filhotes rumo ao pardo. O ambiente de uma geração fixara uma marca que a geração seguinte carregou.

Dois irmãos de ninhada Avy de genótipo idêntico: um camundongo amarelo e obeso, no qual o transpóson a montante do agouti está não metilado, e um pardo pseudoagouti, no qual ele está metilado. — Dois irmãos de ninhada $A^{vy}$ de genótipo idêntico: um camundongo amarelo e obeso, no qual o transpóson a montante do *agouti* está não metilado, e um pardo pseudoagouti, no qual ele está metilado.

Proposição 1.20 (Onde se encontram estados epigenéticos hereditários)

Três sistemas bem analisados ilustram os mecanismos acima. A variegação por efeito de posição em Drosophila: um gene deslocado por um rearranjo cromossômico para junto da heterocromatina é silenciado em algumas células e não em outras, o que dá um olho mosqueado; cada mancha é um clone, o silenciamento se propaga a partir da heterocromatina pela alça da HP1, e os genes cuja mutação suprime a variegação (genes Su(var)) são a HP1 e a metiltransferase da H3K9. A vernalização em Arabidopsis: semanas de frio de inverno silenciam o repressor do florescimento FLC pela H3K27me3 depositada pelo Polycomb, o silêncio se mantém ao longo de meses de crescimento primaveril e de milhares de divisões celulares, e é reiniciado a cada geração, de modo que cada planta precisa passar pelo seu próprio inverno. A paramutação no milho: um alelo do gene de pigmento b1, quando encontra um outro alelo particular num heterozigoto, converte-o ao seu próprio estado silencioso, e o alelo convertido passa o estado a seus descendentes por gerações, através de uma metilação dirigida por RNA pequeno retomada no Capítulo 2. Em cada caso a herança é mitótica e robusta; a transmissão entre gerações é ou ativamente reiniciada (plantas) ou parcial e imperfeita (camundongos).

Observação 1.21 (Os limites das alegações transgeracionais)

Alegações de que a fome ou o estresse de um avô é “herdado epigeneticamente” pelos netos humanos são comuns e em sua maioria não comprovadas. Duas ondas de apagamento se interpõem entre uma marca somática e um neto, os genes sob imprinting e alguns poucos transpósons são os únicos sobreviventes documentados do apagamento em mamíferos, e em coortes humanas os efeitos de um ambiente compartilhado, do ambiente uterino e de diferenças genéticas são difíceis de separar de uma marca carregada na linhagem germinativa. Os casos demonstrados — o $A^{vy}$ , alguns epialelos ligados a transpósons, estados mediados por RNA em vermes e plantas — são reais, molecularmente compreendidos e restritos. O teorema deste capítulo diz por quê: sem uma retroalimentação que empurre $\mu$ para $1$ , uma marca esquece a si mesma em poucas dezenas de divisões, e a linhagem germinativa ainda acrescenta um reinício ativo.

1.6 Exercícios

Exercício 1.1 ★

Dê a composição de uma partícula do cerne do nucleossomo, o comprimento de DNA que ela liga e o comprimento típico do ligante. Por que a digestão da cromatina por nuclease deu uma escada de fragmentos em vez de um rastro contínuo?

Solução

Solução de Exercício 1.1.

Duas cópias de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 (um octâmero) com $147\,\mathrm{bp}$ de DNA em $1.65$ voltas; ligantes de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$ , o que dá uma repetição próxima de $200\,\mathrm{bp}$ . A nuclease corta apenas o DNA ligante exposto, nunca dentro de um cerne, de modo que todo fragmento é um número inteiro de repetições: uma escada de $200$ , $400$ , $600\,\mathrm{bp}$ , e não um rastro.

Exercício 1.2 ★

O genoma de um sapo tem $3.0\times 10^{9}$ pares de bases por conjunto haploide. Quantos nucleossomos contém um núcleo diploide, tomando uma repetição de $190\,\mathrm{bp}$ , e qual é o comprimento de seu DNA?

Solução

Solução de Exercício 1.2.

Diploide: $6.0\times 10^{9}$ bp; $6.0\times 10^{9}/190 \approx 3.2\times 10^{7}$ nucleossomos; comprimento $6.0\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.0\,\mathrm{m}$ .

Exercício 1.3 ★

Decifre H3K27me3, H4K16ac e H3S10ph. Para cada um, diga se está associado a cromatina ativa ou silenciosa, e nomeie um leitor do primeiro.

Solução

Solução de Exercício 1.3.

H3K27me3: histona H3, lisina 27, trimetilada — cromatina silenciosa de genes reprimidos no desenvolvimento, escrita pelo PRC2 e lida pelas proteínas com cromodomínio do PRC1. H4K16ac: H4, lisina 16, acetilada — cromatina ativa e aberta (rompe um contato nucleossomo–nucleossomo). H3S10ph: H3, serina 10, fosforilada — uma marca mitótica associada à condensação cromossômica (e, transitoriamente, à ativação gênica por alguns sinais); não é uma marca estável de silenciamento nem de ativação.

Exercício 1.4 ★

Explique por que uma gata tricolor é quase sempre fêmea, e o que um tricolor macho tem de ser.

Solução

Solução de Exercício 1.4.

O gene alaranjado é ligado ao X e tem um alelo alaranjado e um preto; uma pelagem malhada exige um de cada, em dois cromossomos X diferentes, um dos quais é silenciado por célula. Um macho tem um só X e é inteiramente alaranjado ou inteiramente preto. Um macho tricolor carrega dois cromossomos X e um Y (XXY), e é estéril.

Exercício 1.5 ★★

Calcule a razão de empacotamento da fibra de $10\,\mathrm{nm}$ a partir dos números da Definição 1.1 (repetição $200\,\mathrm{bp}$ , conta $11\,\mathrm{nm}$ ), e a razão necessária para caber os $4\,\mathrm{cm}$ de DNA de um cromossomo humano médio numa cromátide mitótica de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Por qual fator adicional a fibra deve ser dobrada?

Solução

Solução de Exercício 1.5.

$200\,\mathrm{bp}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 68\,\mathrm{nm}$ por conta de $11\,\mathrm{nm}$ : razão $6.2$ . Necessária: $4\,\mathrm{cm}/4\,\text{µ}\mathrm{m} = 10^{4}$ . Dobramento adicional de $10^{4}/6.2 \approx 1600$ .

Exercício 1.6 ★★

No modelo do Teorema 1.10 com $\mu = 0.98$ e $\delta = 0.01$ , determine $p^{*}$ e o número de divisões após o qual um sítio que começou metilado perdeu metade de seu excesso sobre $p^{*}$ . Repita para $\mu = 0.999$ , $\delta = 0.001$ .

Solução

Solução de Exercício 1.6.

$\mu = 0.98$ , $\delta = 0.01$ : $p^{*} = 0.01/0.03 = 0.33$ ; razão $\mu - \delta = 0.97$ ; meia-vida $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisões. $\mu = 0.999$ , $\delta = 0.001$ : $p^{*} = 0.5$ ; razão $0.998$ ; meia-vida $\ln 2 / 0.002 \approx 350$ divisões.

Exercício 1.7 ★★

Um experimento de ChIP-seq em células de fígado dá um pico de H3K4me3 e um pico de H3K27ac no promotor do gene $A$ , um amplo domínio de H3K27me3 sobre o gene $B$ e H3K9me3 sobre o gene $C$ . Preveja o estado transcricional de cada um, e diga qual entre $B$ e $C$ tem mais chance de ser ligado em outro tipo celular, e por quê.

Solução

Solução de Exercício 1.7.

$A$ : ativo (promotor com H3K4me3 e acetilação). $B$ : silencioso, reprimido pelo Polycomb — heterocromatina facultativa, o estado de um gene do desenvolvimento desligado nesta linhagem mas usado em outras, de modo que $B$ é o que tem mais chance de estar ativo em outro tipo celular. $C$ : silencioso, heterocromatina constitutiva (via da HP1), tipicamente repetições ou genes silenciados em todos os tipos celulares.

Exercício 1.8 ★★

Uma mulher é portadora de uma deleção da região UBE3A num dos cromossomos 15, mas é saudável. Seu pai era portador da mesma deleção e também era saudável. De qual síndrome, se alguma, cada um de seus filhos corre risco, e com que probabilidade? E se a deleção tivesse vindo da mãe dela?

Solução

Solução de Exercício 1.8.

O UBE3A é expresso apenas a partir do alelo materno nos neurônios. A deleção dela veio do pai, no alelo que já está silencioso de qualquer modo, e por isso ela é saudável; quando ela a transmite, a deleção passa a ser materna: cada filho tem probabilidade $1/2$ de herdá-la e então tem a síndrome de Angelman. Se a deleção tivesse vindo da mãe dela, ela própria teria a síndrome de Angelman; uma portadora saudável só pode tê-la herdado por via paterna. (Uma deleção paterna de toda a região daria Prader–Willi; o UBE3A sozinho não basta para isso.)

Exercício 1.9 ★★

Preveja a consequência, num embrião de camundongo fêmea, de deletar o gene Xist de um dos cromossomos X; dos dois. Preveja o que um transgene Xist inserido num autossomo faz a esse autossomo.

Solução

Solução de Exercício 1.9.

Um X sem Xist não pode ser inativado, de modo que o outro X é silenciado em todas as células: a inativação é completa, mas deixa de ser aleatória (é enviesada), e o embrião é viável. Os dois X sem Xist: nenhuma inativação, dois cromossomos X ativos, expressão dobrada dos genes ligados ao X, e o embrião fêmea morre cedo. Um transgene Xist num autossomo recobre esse autossomo em cis e silencia seus genes, causando perda de função de uma cópia autossômica — o experimento que mostrou que o Xist basta para silenciar em cis.

Exercício 1.10 ★★★

Explique, com o Exemplo 1.9, por que as ilhas CpG conservaram seus CpGs enquanto o resto do genoma perdeu quatro quintos deles, e o que isso implica sobre o estado de metilação das ilhas na linhagem germinativa ao longo do tempo evolutivo. Por que o argumento falha para um gene metilado apenas no fígado?

Solução

Solução de Exercício 1.10.

As citosinas metiladas se desaminam a timina, que o reparo não reconhece, de modo que um CpG metilado muta para TpG ou CpA a uma taxa alta. Só as sequências não metiladas na linhagem germinativa, geração após geração, conservam seus CpGs; as ilhas conservaram os seus, e portanto estiveram não metiladas na linhagem germinativa durante a maior parte da história dos vertebrados. Um gene metilado apenas no fígado está não metilado no espermatozoide e no óvulo; as mutações que surgem nas células do fígado não são herdadas, de modo que a metilação somática não deixa pegada na sequência.

Exercício 1.11 ★★★

Mostre, usando a alça escritor–leitor da Proposição 1.5, como um domínio de H3K9me3 pode ser estável através da replicação embora cada divisão dilua as histonas marcadas pela metade com histonas novas sem marca. O que determina onde o domínio para de se propagar? Proponha um experimento para testar sua explicação.

Solução

Solução de Exercício 1.11.

Na replicação as histonas antigas, marcadas, são repartidas entre os dois dúplexes-filhos e intercaladas com histonas novas sem marca, de modo que cada domínio-filho fica cerca de metade marcado. A HP1 ligada a um nucleossomo marcado retido recruta a SUV39H, que metila os vizinhos sem marca; enquanto os nucleossomos marcados forem densos o bastante para levar um escritor a cada lacuna, o domínio é recomposto antes da divisão seguinte — a mesma retroalimentação do $\mu$ alto do teorema. A propagação para nas fronteiras: proteínas isolantes (CTCF), genes muito transcritos e genes de tRNA, nucleossomos com marcas ativas incompatíveis (H3K4me3, acetilação) que o escritor não consegue usar, e o ponto em que os apagadores (desmetilases, renovação das HDAC) superam o escritor. Teste: recrute a HP1 transitoriamente para um gene repórter (uma fusão com um domínio de ligação ao DNA cuja ligação seja controlada por fármaco), solte-a e acompanhe o silêncio do repórter e a H3K9me3 ao longo das divisões; preveja uma persistência que depende do escritor, e a perda se o escritor ou a dimerização do leitor estiverem mutados, ou se um isolante for colocado dentro do domínio.

Exercício 1.12 ★★★

Um estudo relata que os netos de pessoas que passaram por uma fome têm metilação alterada num gene de crescimento e maior massa corporal. Liste as explicações alternativas que precisam ser excluídas antes de concluir que uma marca de metilação foi transmitida pela linhagem germinativa, e diga que experimento em camundongos resolveria a questão.

Solução

Solução de Exercício 1.12.

Excluir: um ambiente compartilhado (a dieta e a pobreza dos próprios netos); um efeito uterino — a filha da mãe exposta à fome era um feto, com suas células germinativas já presentes, de modo que a linhagem germinativa do neto foi exposta diretamente e o efeito não é transgeracional; diferenças genéticas entre as famílias que sobreviveram e as que não; causalidade reversa (a própria massa corporal altera a metilação no sangue); diferenças na composição das células do sangue; e testes múltiplos ao longo de muitos CpGs. Experimento em camundongos: exponha machos F $_0$ de linhagem isogênica (sem via uterina), cruze-os com fêmeas não expostas ou use fecundação in vitro e transferência de embriões, e acompanhe F $_2$ e F $_3$ pela linha paterna, medindo a metilação no esperma de cada geração; uma marca que persiste no esperma e no fenótipo da F $_3$ , numa linhagem sem variação genética, é transmissão germinativa.

1.7 Problema: a memória de um gene silenciado

Problema 1.1

Problema de fim de semana — um genoma humano acondicionado em seu núcleo, uma marca de metilação acompanhada ao longo das divisões, uma gata tricolor lida como mapa clonal e as doenças de uma região sob imprinting contadas, terminando no número de divisões que uma marca sobrevive sem retroalimentação e no tamanho da população de células que escolheu seu X

Dados: um núcleo diploide humano contém $6.4\times 10^{9}$ pares de bases, a $0.34\,\mathrm{nm}$ e $650\,\mathrm{Da}$ por par; a repetição do nucleossomo é de $200\,\mathrm{bp}$ , um octâmero de histonas pesa $108\,\mathrm{kDa}$ e uma partícula do cerne é um disco de $11\,\mathrm{nm}$ de diâmetro e $5.5\,\mathrm{nm}$ de espessura. O núcleo é uma esfera de $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diâmetro. O genoma tem $42\,\%$ de G $+$ C. Metilação num CpG comum: $\mu = 0.99$ , $\delta = 0.02$ por divisão.

Parte I — O empacotamento.

Calcule o comprimento total de DNA no núcleo e o número de nucleossomos.
Calcule a massa total de histonas (apenas os octâmeros) e a de DNA, em picogramas ( $1\,\mathrm{Da} = 1.66 \times 10^{-24}\,\mathrm{g}$ ).
Calcule o volume do núcleo e o volume total das partículas do cerne, tratadas como cilindros. Que fração do núcleo elas preenchem?
Se os nucleossomos fossem dispostos ponta a ponta como uma fibra de $10\,\mathrm{nm}$ , qual seria o comprimento da fibra e qual a razão de empacotamento em relação ao DNA nu?
A fibra é dobrada em alças de $200\,\mathrm{kb}$ ancoradas pela coesina. Quantas alças, e quantos nucleossomos por alça?
Sob a hipótese de independência, quantos dinucleotídeos CpG o genoma diploide conteria? O número observado é $5.6\times 10^{7}$ . Que fração se perdeu, e por qual mecanismo mutacional?

Parte II — Uma marca ao longo das divisões.

Escreva a recorrência de $p_{n}$ e calcule $p^{*}$ .
Um CpG de promotor está totalmente metilado em $n = 0$ . Calcule $p_{n}$ após $10$ , $50$ e $200$ divisões.
Após quantas divisões o excesso $p_{n} - p^{*}$ cai pela metade? Uma célula-tronco tecidual se divide cerca de uma vez por semana: quantos anos são esses?
Um fármaco inibe completamente a DNMT1 ( $\mu = 0$ ) e também a DNMT3 ( $\delta = 0$ ). Mostre que a fração de fitas metiladas na população cai pela metade a cada divisão, e determine o número de divisões para levar $80\,\%$ de metilação a menos de $5\,\%$ .
Numa ilha silenciada os leitores de metil-CpG recrutam a metilação da H3K9, que recruta a DNMT3, de modo que dentro da ilha $\mu = 0.9995$ e $\delta = 0.0005$ . Recalcule a meia-vida do excesso, em divisões e em anos a uma divisão por semana.
Explique numa frase por que é o resultado da questão 11, e não o da questão 9, o que um gene silenciado por toda a vida exige, e que tipo de arranjo molecular o produz.

Parte III — O mapa da gata tricolor.

Uma gata é heterozigótica para o gene alaranjado ligado ao X. Explique por que sua pelagem tem manchas alaranjadas e pretas e o que representa uma mancha.
A inativação do X ocorreu quando as células destinadas a formar a pele eram $N$ . Cada uma escolheu um X ao acaso. Qual é a probabilidade de todas as $N$ terem escolhido o mesmo, o que daria uma gata de cor única?
Nenhuma heterozigota de cor única foi documentada entre talvez um bilhão de gatas; tome a probabilidade como $10^{-9}$ e estime $N$ .
A superfície da pele da gata é de cerca de $0.3\,\mathrm{m}^{2}$ e suas manchas têm em média $15\,\mathrm{cm}^{2}$ . Estime o número de manchas e explique por que ele é maior que $N$ .
Um gato XXY também é tricolor. Quantos corpúsculos de Barr exibem suas células? Quantos numa fêmea XXX e num macho XY?
Um gene que escapa da inativação está presente em duas cópias ativas nas fêmeas e em uma nos machos. Dê uma razão pela qual esse escape pode ser tolerado e uma situação em que ele importa.

Parte IV — O cromossomo 15.

A síndrome de Prader–Willi afeta cerca de um nascimento em $15\,000$ ; $70\,\%$ dos casos são uma deleção de novo do 15q11–q13 paterno e $25\,\%$ uma dissomia uniparental materna. Calcule a frequência de nascimento de cada causa.
A síndrome de Angelman tem mais ou menos a mesma frequência; $70\,\%$ são deleções maternas, $5\,\%$ dissomias paternas e $10\,\%$ mutações pontuais do UBE3A. Por que as mutações pontuais são uma causa de Angelman, mas quase nunca de Prader–Willi?
Um pai é portador de uma translocação balanceada que dá a $20\,\%$ de seus espermatozoides uma deleção 15q11–q13. Que fração de seus filhos tem Prader–Willi, e que fração Angelman?
A dissomia uniparental surge quando um zigoto trissômico perde um cromossomo. Se um zigoto com trissomia do 15 perde ao acaso um de seus três cromossomos, e a trissomia veio da mãe (duas cópias maternas), qual é a probabilidade de o sobrevivente ter dissomia materna? Qual síndrome?
Os genes de Prader–Willi são de expressão paterna e o gene de Angelman, de expressão materna. Usando a teoria do parentesco, diga quais dos sintomas das duas síndromes (dificuldade de alimentação ao nascer contra apetite voraz) se encaixam na teoria e quais são mais difíceis de encaixar.
Propõe-se um método de tratar a síndrome de Angelman reativando o UBE3A paterno silencioso. Seu silêncio se deve a um RNA antissenso de expressão paterna. Proponha o alvo molecular e diga por que a terapia não perturbaria os outros genes sob imprinting.
Resuma: a meia-vida de uma marca sem retroalimentação (questão 9) e com ela (questão 11), em divisões; e a população fundadora $N$ da pelagem tricolor (questão 15).

Solução

Solução de Problema 1.1.

1. $6.4\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.2\,\mathrm{m}$ ; $6.4\times 10^{9}/200 = 3.2\times 10^{7}$ nucleossomos. 2. Histonas: $3.2\times 10^{7}\times 1.08\times 10^{5} = 3.5\times 10^{12}$ Da $= 5.7\,\mathrm{pg}$ . DNA: $6.4\times 10^{9}\times 650 = 4.2\times 10^{12}$ Da $= 6.9\,\mathrm{pg}$ . Massas comparáveis. 3. Núcleo: $\tfrac{4}{3}\pi\,(5\,\text{µ}\mathrm{m})^{3} = 520\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ . Cerne: $\pi\,(5.5)^{2}\times 5.5 = 520\,\mathrm{nm}^{3} = 5.2\times 10^{-7}\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ ; total $3.2\times 10^{7}\times 5.2\times 10^{-7} = 17\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ : cerca de $3\,\%$ do núcleo. 4. $3.2\times 10^{7}\times 11\,\mathrm{nm} = 0.35\,\mathrm{m}$ ; razão de empacotamento $2.2/0.35 \approx 6$ . 5. $6.4\times 10^{9}/2\times 10^{5} = 32\,000$ alças de $1000$ nucleossomos cada. 6. $0.21^{2}\times 6.4\times 10^{9} = 2.8\times 10^{8}$ ; observados $5.6\times 10^{7}$ , ou seja $80\,\%$ perdidos, por desaminação da 5-metilcitosina a timina (transições C $\to$ T não reparadas nos CpGs metilados). 7. $p_{n+1} = 0.99\,p_{n} + 0.02\,(1 - p_{n}) = 0.97\,p_{n} + 0.02$ ; $p^{*} = 0.02/0.03 = 0.67$ . 8. $p_{n} = 0.67 + 0.33\times 0.97^{n}$ : $n = 10$ : $0.91$ ; $n = 50$ : $0.74$ ; $n = 200$ : $0.67$ (o excesso é $7\times 10^{-4}$ ). 9. $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisões; a uma por semana, cerca de $23$ semanas — cinco meses. 10. Cada replicação emparelha uma fita antiga, ainda metilada, com uma fita nova que enzima nenhuma metila; as fitas antigas não são nem ganhas nem perdidas, o número de fitas dobra, e portanto a fração metilada cai pela metade. $0.80/2^{n} < 0.05$ exige $2^{n} > 16$ : cinco divisões ( $0.025$ ; quatro dão exatamente $5\,\%$ ). 11. Razão $0.9995 - 0.0005 = 0.999$ ; meia-vida $\ln 2/(-\ln 0.999) \approx 690$ divisões, cerca de $13$ anos a uma por semana. 12. Um gene silencioso por uma vida inteira de umas $4000$ divisões semanais precisa de uma meia-vida de centenas de divisões, que só a retroalimentação da questão 11 dá: os leitores da marca (MeCP2, HP1) recrutam seus escritores (metilase da H3K9, DNMT3), de modo que um domínio denso de marcas se copia com uma eficiência que enzima nenhuma tem sozinha. 13. Um X carrega o alelo alaranjado, o outro o preto; toda célula da pele silenciou um X e expressa apenas o outro; os descendentes de uma célula mantêm sua escolha, de modo que uma mancha é um clone (ou um grupo de clones vizinhos) que fez a mesma escolha. 14. Todas as $N$ escolhem o X que carrega o alaranjado, ou todas escolhem o outro: $2\times (1/2)^{N} = 2^{1-N}$ . 15. $2^{1-N} = 10^{-9}$ : $N - 1 = \log_{2} 10^{9} = 29.9$ , $N \approx 30$ células. 16. $3000\,\mathrm{cm}^{2}/15\,\mathrm{cm}^{2} = 200$ manchas, bem mais que $30$ fundadoras: durante o crescimento os descendentes de uma fundadora são dispersados pela mistura e pela migração celular, de modo que um clone forma várias ilhas (e vizinhas com a mesma escolha se fundem, o que puxa no sentido contrário, mas menos). 17. Um corpúsculo de Barr por X além do primeiro: XXY um, XXX dois, XY nenhum. 18. Tolerado quando o gene tem um homólogo funcional no Y, de modo que os machos também têm duas cópias (os genes pseudoautossômicos e pares como KDM5C/KDM5D); importa nas aneuploidias do X — na síndrome de Turner (XO) os genes que escapam estão presentes em cópia única, que é por que um indivíduo XO não é simplesmente uma fêmea normal (haploinsuficiência do SHOX e baixa estatura), e no XXY os que escapam ficam em dose excessiva. 19. $1/15\,000 = 6.7\times 10^{-5}$ ; deleções $0.70\times 6.7\times 10^{-5} = 4.7\times 10^{-5}$ (uma em $21\,000$ ); dissomia materna $1.7\times 10^{-5}$ (uma em $60\,000$ ). 20. A síndrome de Angelman é a perda de um só gene, o UBE3A, de modo que uma única mutação pontual no alelo materno basta. Prader–Willi é a perda de vários genes de expressão paterna ao mesmo tempo (SNRPN, o agrupamento de RNAs pequenos); uma mutação pontual inativa um deles e dá no máximo um fenótipo parcial, nunca a síndrome inteira. 21. $20\,\%$ dos filhos recebem uma deleção paterna e têm Prader–Willi; nenhum tem Angelman, que exige uma deleção materna. 22. Três cromossomos, dois maternos e um paterno, um perdido ao acaso: o paterno se perde com probabilidade $1/3$ , o que deixa dissomia materna e Prader–Willi; com probabilidade $2/3$ perde-se uma cópia materna e a criança é normal. 23. Os genes paternos deveriam promover a demanda sobre a mãe; sua perda (Prader–Willi) deveria reduzir a demanda — o que se encaixa na sucção fraca e no baixo ganho de peso do recém-nascido —, ao passo que o apetite insaciável posterior é o oposto e é mais difícil de encaixar (uma leitura proposta é que os genes paternos normalmente empurram a criança rumo ao desmame). Angelman, a perda de um gene materno, deveria aumentar a demanda; a sucção prolongada e os despertares noturnos frequentes das crianças com Angelman se encaixam, as convulsões e a perda da fala não têm nada a ver com recursos. 24. Ter como alvo o transcrito antissenso paterno (UBE3A-ATS) com um oligonucleotídeo antissenso que o degrade ou bloqueie sua elongação: o UBE3A paterno está intacto e é silenciado apenas em cis por esse RNA, de modo que retirar o RNA restabelece sua expressão. A metilação da região controladora do imprinting fica intocada, e portanto o SNRPN e os demais genes sob imprinting conservam seu padrão parental normal. 25. Meia-vida de uma marca: cerca de $23$ divisões sem retroalimentação, cerca de $690$ com ela; a pelagem tricolor foi decidida por uma população fundadora de cerca de $30$ células.

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