Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

14Microbiomas e simbioses

Você carrega cerca de trinta e oito trilhões de bactérias, mais ou menos uma para cada célula sua, a maioria delas no último metro de seu intestino, onde pesam quase tanto quanto seu cérebro e carregam cem vezes mais genes que você. Um camundongo criado sem nenhuma delas precisa de um terço a mais de comida para manter o peso, tem um sistema imune atrofiado e se comporta de modo estranho. Uma ervilheira entrega um décimo de seu açúcar a bactérias em nódulos de suas raízes e recebe nitrogênio em troca; quatro quintos de todas as plantas terrestres trocam açúcar por fosfato com fungos enrolados em suas raízes, como fazem há quatrocentos milhões de anos; um coral é um animal que cultiva algas dentro de suas células e morre quando o mar esquenta o bastante para fazê-lo expulsá-las. Os seres vivos não são indivíduos, mas consórcios, e este capítulo trata da biologia dessas parcerias: como são contadas e caracterizadas por sequenciamento, o que os parceiros trocam, como a troca é negociada e fiscalizada, e por que alguns parceiros acabam como organelas.

14.1 Palavras para conviver

Definição 14.1 (Simbiose)

A simbiose é a associação sustentada e íntima de organismos de espécies diferentes; ela é um mutualismo se os dois ganham, um comensalismo se um ganha e o outro não é afetado, e um parasitismo se um ganha às custas do outro — e um mesmo par pode se deslocar ao longo dessa linha conforme as circunstâncias. Um endossimbionte vive dentro das células de seu hospedeiro; um parceiro obrigatório não consegue viver sozinho. Os simbiontes são transmitidos verticalmente, de genitor a descendente (as Buchnera do pulgão passam pelo ovo), ou horizontalmente, adquiridos de novo a cada geração do ambiente ou de outros hospedeiros (o Vibrio da lula, as bactérias do intestino humano). O microbioma é toda a comunidade de micróbios de um hábitat — um intestino, a superfície de uma folha, um grama de solo — e o holobionte é um hospedeiro junto com seu microbioma, considerado como a unidade que a seleção natural enxerga.

Exemplo 14.2 (Três parceiros obrigatórios)

A Buchnera do pulgão vive dentro das células de seu hospedeiro há duzentos milhões de anos, faz os aminoácidos essenciais que faltam à seiva do floema e encolheu seu genoma a $640\,\mathrm{kb}$ — um sétimo do de suas parentes de vida livre —, perdendo cada gene que o hospedeiro agora fornece. A bactéria Wolbachia, presente em dois terços das espécies de insetos, é transmitida só pelos ovos e por isso evoluiu para favorecer as fêmeas: ela mata embriões machos, feminiza-os, ou faz os ovos de fêmeas não infectadas morrerem quando fecundados por machos infectados (a incompatibilidade citoplasmática), o que a espalha por uma população; mosquitos que a carregam transmitem mal a dengue, e soltá-los reduziu a dengue em várias cidades. A ameba Paulinella acolheu uma cianobactéria há cerca de cem milhões de anos, que hoje não é bem uma bactéria nem bem um cloroplasto — uma segunda origem independente de organelas fotossintéticas, apanhada no meio do caminho.

14.2 Contar uma comunidade

Método 14.3 (Perfilar um microbioma por sequenciamento)

A maioria dos micróbios não pode ser cultivada; eles são contados por seu DNA. (1) Extraia o DNA da amostra — fezes, solo, água do mar filtrada numa membrana. (2) Ou amplifique o gene do RNA ribossômico da subunidade pequena (o 16S) com iniciadores que correspondam a suas regiões universais, e sequencie as regiões variáveis entre elas — um levantamento de amplicons, barato, que identifica bactérias até mais ou menos o gênero e as conta pelo número de leituras; ou sequencie todo o DNA — a metagenômica aleatória, que recupera genes e genomas inteiros e assim relata o que a comunidade sabe fazer, e não apenas quem está lá. (3) Agrupe as leituras em variantes de sequência ou em unidades taxonômicas operacionais (OTUs, convencionalmente a $97\,\%$ de identidade para uma “espécie”), atribua-as por comparação com bancos de dados (Capítulo 5) e tabule as contagens por amostra. (4) Calcule a diversidade dentro de uma amostra e compare a composição entre amostras. As contagens são relativas — as leituras de uma amostra somam um total fixo — e são enviesadas pela extração, pelos iniciadores e pelo número de cópias, de modo que as diferenças entre amostras processadas do mesmo modo são confiáveis onde os números absolutos não são.

Definição 14.4 (Diversidade)

Para uma comunidade de $S$ espécies com abundâncias relativas $p_{1},\dots, p_{S}$ ( $\sum p_{i} = 1$ ): a riqueza é $S$ ; o índice de Shannon $H = -\sum_{i} p_{i}\ln p_{i}$ mede a incerteza sobre a espécie de um indivíduo sorteado ao acaso, e $e^{H}$ é o número de espécies igualmente abundantes que daria a mesma incerteza (o número efetivo de espécies); o índice de Simpson $D = \sum_{i} p_{i}^{2}$ é a probabilidade de dois indivíduos sorteados ao acaso serem da mesma espécie, e $1/D$ é outro número efetivo, ponderado a favor das espécies comuns. A riqueza depende de quantos indivíduos se examinou: uma curva de rarefação representa as espécies encontradas contra o número de indivíduos amostrados, e se achata quando a maioria das espécies já foi vista.

Teorema 14.5 (Rarefação)

Uma amostra contém $N$ indivíduos de $S$ espécies, $N_{i}$ da espécie $i$ . O número esperado de espécies numa subamostra aleatória de $n$ indivíduos, sorteada sem reposição, é

E[S_{n}] = \sum_{i=1}^{S}\left[1 - \frac{\binom{N - N_{i}}{n}} {\binom{N}{n}}\right],

que sobe com $n$ e vale $S$ em $n = N$ . Duas amostras de tamanhos diferentes são comparadas rarefazendo as duas ao mesmo $n$ . A fração dos indivíduos da comunidade que pertencem a espécies ainda não vistas é estimada pela cobertura de Good: cerca de $f_{1}/N$ , em que $f_{1}$ é o número de espécies vistas exatamente uma vez (os singletons).

Demonstração. A espécie $i$ está ausente da subamostra exatamente quando todos os $n$ indivíduos são sorteados entre os $N - N_{i}$ outros, o que acontece em $\binom{N - N_{i}}{n}$ das $\binom{N}{n}$ subamostras igualmente prováveis; logo a espécie $i$ está presente com probabilidade $1 - \binom{N-N_{i}}{n}/ \binom{N}{n}$ , e a contagem esperada de espécies presentes é a soma dessas probabilidades (a esperança de uma soma de indicadores). Cada termo cresce com $n$ , e em $n = N$ todo binomial do numerador é zero. A estimativa de Good: um indivíduo sorteado a seguir pertence a uma espécie não vista com mais ou menos a probabilidade de um indivíduo sorteado ao acaso da amostra ser o único de seu tipo, $f_{1}/N$ (Good, 1953); sua justificativa é aqui admitida. ∎

Exemplo 14.6 (Dois intestinos)

Uma amostra de $1000$ leituras de uma pessoa dá $150$ espécies, com $H = 3.5$ e $40$ singletons; uma amostra de $5000$ leituras de outra dá $260$ espécies. A segunda não é necessariamente mais diversa: ela foi amostrada cinco vezes mais a fundo, e rarefazê-la a $1000$ leituras pode dar $150$ também. A cobertura da primeira amostra é $1 - 40/1000 = 96\,\%$ : quatro por cento das bactérias daquele intestino pertencem a espécies que a amostra nunca viu, e uma amostra mais profunda as encontrará. Os números efetivos — $e^{3.5} \approx 33$ espécies em equitatividade contra uma riqueza de $150$ — dizem que umas poucas espécies dominam, que é como todo intestino se apresenta.

Curvas de rarefação. As espécies encontradas sobem com as leituras amostradas e se achatam à medida que a comunidade se esgota; duas amostras são comparadas na mesma profundidade. Aqui o segundo intestino ainda está subindo em 5000 leituras, de modo que sua riqueza verdadeira é ainda maior. — Curvas de rarefação. As espécies encontradas sobem com as leituras amostradas e se achatam à medida que a comunidade se esgota; duas amostras são comparadas na mesma profundidade. Aqui o segundo intestino ainda está subindo em $5000$ leituras, de modo que sua riqueza verdadeira é ainda maior.

14.3 O microbioma humano

Definição 14.7 (A comunidade do intestino)

O intestino humano abriga cerca de $4\times 10^{13}$ bactérias, quase todas no cólon, a $10^{11}$ por grama de conteúdo, contra $10^{3}$ por grama no estômago ácido e $10^{4}$ – $10^{7}$ ao longo do intestino delgado, cujo fluxo é rápido e cuja bile é hostil. Umas quinhentas a mil espécies por pessoa, a maioria de dois filos, os Bacteroidetes e os Firmicutes, quase todas anaeróbias; o conjunto de cada pessoa é distinto e estável por anos, fixado em grande parte nos três primeiros anos de vida a partir da mãe e da casa. O que elas fazem: fermentam a fibra que as enzimas humanas não digerem em ácidos graxos de cadeia curta — acetato, propionato, butirato —, que alimentam as próprias células do cólon e fornecem até um décimo das calorias do hospedeiro; produzem vitamina K e algumas vitaminas do complexo B; transformam ácidos biliares e fármacos; ocupam cada nicho, de modo que um invasor não encontra apoio (a resistência à colonização); e treinam o sistema imune, cujos linfócitos T reguladores e células secretoras de IgA se desenvolvem em resposta a elas (Capítulo 16). Uma comunidade afastada desse estado — menos espécies, menos fermentadoras, mais aeróbias facultativas — é uma disbiose, vista na doença inflamatória intestinal, depois de antibióticos e na obesidade, embora em geral não esteja claro o que é causa e o que é efeito.

Evidência. Camundongos criados livres de germes em isoladores estéreis (Gordon e colaboradores, anos 2000) têm paredes intestinais finas, órgãos linfoides pequenos, níveis baixos de anticorpos e precisam de $30\,\%$ mais calorias para manter o peso; colonizados com uma microbiota normal de camundongo, ganham gordura em duas semanas. Recebendo a microbiota de um camundongo obeso em vez da de um magro, camundongos livres de germes ganharam mais gordura com a mesma comida (Turnbaugh, 2006): a própria comunidade afeta a colheita de energia. Nos humanos, a colite recorrente por Clostridioides difficile — uma disbiose em que os antibióticos removeram os concorrentes de um esporulador produtor de toxina — foi curada em $94\,\%$ dos pacientes pela infusão das fezes de um doador saudável, contra $31\,\%$ com o antibiótico padrão (van Nood, 2013), o primeiro ensaio randomizado em que o fármaco foi uma comunidade, e não uma molécula. ∎

Densidade bacteriana ao longo do intestino humano, em escala logarítmica: uma subida de cem milhões de vezes do estômago ácido até o cólon, onde vivem quase todos os micróbios do corpo.

A superfície do revestimento intestinal no microscópio eletrônico de varredura, com bactérias de vários tipos alojadas no muco entre as vilosidades.

14.4 As plantas e seus parceiros

Definição 14.8 (A simbiose leguminosa–rizóbio)

As leguminosas abrigam bactérias fixadoras de nitrogênio (os rizóbios) em nódulos radiculares, órgãos construídos para isso depois de um diálogo molecular. A raiz secreta flavonoides; um rizóbio da espécie correspondente responde com fatores Nod — lipoquito-oligossacarídeos cujos ornamentos especificam o parceiro; uma cinase receptora do pelo radicular os liga e dispara oscilações de cálcio no núcleo, o encurvamento do pelo em torno das bactérias e um cordão de infecção que cresce para dentro através das células, enquanto o córtex abaixo começa a se dividir num nódulo. As bactérias são liberadas nas células do nódulo dentro de membranas e se diferenciam em bacteroides que expressam a nitrogenase, a enzima que reduz o N $_{2}$ a amônia ao custo de dezesseis ATP por molécula. A nitrogenase é destruída pelo oxigênio, e ainda assim os bacteroides respiram muito; o nódulo resolve a contradição com uma barreira de difusão e com a leghemoglobina, uma hemoglobina vegetal que liga o oxigênio com força e o entrega aos bacteroides numa concentração livre baixa — é ela que faz um nódulo cortado ser rosa. A planta paga de seis a dez por cento de seu fotossintato e recebe a maior parte de seu nitrogênio; o nitrogênio fixado pelas leguminosas cultivadas no mundo se aproxima do da indústria de fertilizantes.

Fazer um nódulo. Os flavonoides da raiz e os fatores Nod do rizóbio identificam os parceiros; o pelo radicular se encurva, um cordão de infecção leva as bactérias para dentro, e o córtex constrói um nódulo em que os bacteroides, mantidos em baixo oxigênio pela leghemoglobina, fixam nitrogênio em troca de açúcar.

Definição 14.9 (Micorrizas)

As micorrizas são associações de raízes com fungos, encontradas em uns $80\,\%$ das espécies vegetais e nos fósseis mais antigos de plantas terrestres. Nas micorrizas arbusculares o fungo entra nas células da raiz e se ramifica num arbúsculo em forma de árvore, através do qual fosfato, nitrogênio e água passam à planta, e açúcares e lipídios ao fungo; as hifas fúngicas estendem cem vezes a superfície de absorção da raiz e alcançam fosfato que a raiz não alcança. Nas ectomicorrizas, das árvores de floresta, o fungo embainha a raiz e cresce entre as células. Os genes vegetais que admitem o fungo são a mesma via comum da simbiose — receptor, picos de cálcio, fatores de transcrição — que as leguminosas reaproveitam para os rizóbios: o nódulo é uma invenção tardia construída sobre uma parceria fúngica quatrocentos milhões de anos mais velha.

Proposição 14.10 (O comércio e sua fiscalização)

Um mutualismo é uma troca, e cada parceiro é selecionado para dar menos e receber mais; ele persiste porque o outro parceiro pode retaliar. As leguminosas restringem o oxigênio aos nódulos cujos rizóbios não fixam nitrogênio, reduzindo à metade sua reprodução (Kiers, 2003): as sanções. As plantas em redes micorrízicas destinam mais carbono aos parceiros fúngicos que entregam mais fosfato, e os fungos mais fosfato às raízes que pagam mais carbono — um mercado em que os dois lados recompensam o melhor negociante (Kiers, 2011). As lulas expelem as bactérias do órgão de luz que não brilham; os sistemas imunes humanos toleram os comensais que ficam no lúmen e atacam os que cruzam a parede. Onde um hospedeiro não pode nem escolher nem sancionar — um endossimbionte herdado pelo ovo —, o alinhamento de interesses vem, em vez disso, do destino compartilhado: um simbionte de transmissão vertical só se reproduz quando seu hospedeiro se reproduz, e a seleção sobre o simbionte favorece a reprodução do hospedeiro. O modo de transmissão, assim, prevê o caráter da parceria: a transmissão vertical rumo ao mutualismo e à dependência, e a horizontal rumo à exploração contida pela fiscalização.

Demonstração. Admitido neste nível. ∎

À esquerda: as raízes noduladas de uma leguminosa, cada nódulo rosa uma fábrica de nitrogênio de bacteroides alimentada com açúcar. À direita: liquens sobre rocha — cada um um fungo que abriga uma alga fotossintética ou uma cianobactéria, colonizando juntos uma superfície que nenhum dos dois manteria sozinho.

14.5 Parcerias no mar e em outros lugares

Definição 14.11 (O coral e a alga)

Os corais construtores de recifes abrigam algas dinoflageladas (as Symbiodiniaceae, as zooxantelas) dentro das células do revestimento de seu intestino, um milhão ou mais por centímetro quadrado. As algas fazem fotossíntese no tecido do animal, usando o CO $_{2}$ , a amônia e o fosfato de resíduo do animal, e devolvem até $90\,\%$ do carbono que fixam como glicerol, açúcares e aminoácidos, que alimentam o coral e a calcificação que constrói o recife; o coral, por sua vez, controla o suprimento de nitrogênio das algas e, com isso, seu crescimento. A parceria funciona dentro de uma janela térmica estreita: quando a água fica cerca de um a dois graus acima do máximo de verão por algumas semanas, a fotossíntese das algas é danificada, elas liberam oxigênio reativo nas células hospedeiras e o coral as expulsa — o branqueamento, com o esqueleto branco aparecendo através do animal translúcido. Um coral branqueado passa fome; ele se recupera se a água esfriar em poucas semanas, e morre se não esfriar. A frequência do branqueamento subiu cinco vezes desde 1980, e é o mecanismo pelo qual o aquecimento está removendo os recifes.

Exemplo 14.12 (Simbioses que fazem hábitats)

Um líquen é um fungo que abriga uma alga verde ou uma cianobactéria, com o fungo fornecendo estrutura, retenção de água e minerais dissolvidos da rocha, e o fotobionte fornecendo açúcar (e, se for uma cianobactéria, nitrogênio); os liquens cobrem cerca de $8\,\%$ da superfície terrestre, colonizam rocha nua e começam sua conversão em solo. O verme tubícola Riftia das fontes hidrotermais profundas não tem boca nem intestino quando adulto; ele abriga bactérias oxidadoras de sulfeto num trofossomo e lhes entrega sulfeto e oxigênio numa hemoglobina que liga os dois, crescendo mais de um metro por ano no escuro, com energia química. Os cupins digerem madeira com uma comunidade intestinal de protistas e bactérias, e os ruminantes digerem capim com um rúmen do tamanho de uma banheira em que bactérias, arqueias e fungos fermentam a celulose em ácidos graxos e metano; a vaca vive dos ácidos graxos e dos corpos dos próprios micróbios. Em cada caso, uma capacidade metabólica — fotossíntese, fixação de nitrogênio, oxidação de sulfeto, digestão de celulose — que a linhagem hospedeira nunca evoluiu foi adquirida por parceria numa única etapa.

Um recife metade branqueado: as colônias brancas expulsaram suas algas depois de semanas de água quente demais; as marrons ainda conservam as suas. O coral branco está vivo e passando fome, e tem semanas para ser recolonizado.

A troca coral–alga: a alga fixa carbono com os resíduos do animal e com a luz que atravessa seu tecido, e devolve a maior parte dele como alimento; uma elevação pequena e sustentada da temperatura rompe a parceria.

14.6 De parceiro a organela

Proposição 14.13 (Redução do genoma e o caminho até a organela)

Um endossimbionte herdado pelo ovo vive numa população de algumas poucas células que nunca recombinam com forasteiras. A seleção sobre ele é fraca (Capítulo 25: uma população pequena fixa por deriva mutações levemente danosas), os genes cujos produtos o hospedeiro fornece não fazem falta quando quebram, e um gene perdido nunca é reavido. O genoma, portanto, encolhe geração após geração — a Buchnera a $640\,\mathrm{kb}$ , alguns simbiontes de insetos a $140\,\mathrm{kb}$ e algumas centenas de genes, a mitocôndria a $16\,\mathrm{kb}$ e treze proteínas nos humanos —, e o núcleo do hospedeiro adquire cópias dos genes do simbionte por transferência gênica endossimbiótica, cujos produtos são importados de volta com uma sequência de endereçamento. Quando o hospedeiro faz a maioria das proteínas do simbionte, controla sua divisão e não consegue viver sem ele, o simbionte se tornou uma organela. As mitocôndrias e os plastídios percorreram esse caminho há dois bilhões e um bilhão de anos (o volume do 1.º ano); o cromatóforo da Paulinella é um terceiro viajante, cem milhões de anos estrada afora.

Observação 14.14 (O indivíduo revisitado)

Um animal ou uma planta é uma comunidade com um genoma em seu centro, e a maior parte de seu repertório metabólico, e boa parte de seu desenvolvimento e de sua imunidade, depende de parceiros que ele não herdou em seu próprio DNA. As consequências práticas já estão aqui: o microbioma como fármaco (o transplante fecal), como alvo de fármacos (o dano colateral dos antibióticos, a fibra alimentar como prescrição), como diagnóstico e como rota — por simbiontes projetados e mosquitos que carregam Wolbachia — para mudar a biologia de populações silvestres. A consequência teórica é que a seleção natural age sobre parcerias, e que as parcerias mais fortes são aquelas em que o destino de um parceiro é o do outro.

14.7 Exercícios

Exercício 14.1 ★

Defina mutualismo, comensalismo e parasitismo, e dê um exemplo de cada um neste capítulo. Por que um mesmo par de espécies pode se mover entre as categorias?

Solução

Solução de Exercício 14.1.

Mutualismo: os dois ganham — leguminosa e rizóbio, coral e alga. Comensalismo: um ganha e o outro não é afetado — a maioria das bactérias do intestino, que se alimentam do que o hospedeiro não digere. Parasitismo: um ganha ao custo do outro — a Wolbachia matando embriões machos. O mesmo par pode mudar: um comensal do intestino que cruza a parede vira patógeno, um rizóbio que para de fixar vira parasito do nódulo, e uma alga sob estresse térmico faz mal ao coral que a abrigava.

Exercício 14.2 ★

Calcule $H$ , $e^{H}$ , $D$ e $1/D$ para uma comunidade com abundâncias $0.5$ , $0.3$ , $0.1$ , $0.05$ , $0.05$ .

Solução

Solução de Exercício 14.2.

$H = -(0.5\ln 0.5 + 0.3\ln 0.3 + 0.1\ln 0.1 + 2\times 0.05\ln 0.05) = 0.347 + 0.361 + 0.230 + 0.300 = 1.24$ ; $e^{H} = 3.4$ espécies efetivas. $D = 0.25 + 0.09 + 0.01 + 0.0025 + 0.0025 = 0.355$ ; $1/D = 2.8$ .

Exercício 14.3 ★

Contraste um levantamento de amplicons do 16S com a metagenômica aleatória: o que cada um relata, e o que cada um não consegue dizer?

Solução

Solução de Exercício 14.3.

O levantamento do 16S relata quem está lá, até mais ou menos o gênero, e suas contagens relativas de leituras; nada diz sobre os genes que eles carregam, deixa passar fungos e vírus (que exigem outros iniciadores) e é enviesado pelo número de cópias e pelos iniciadores. A metagenômica aleatória relata genes, funções e, com profundidade bastante, genomas e linhagens inteiras; custa mais por amostra, é soterrada pelo DNA do hospedeiro em amostras de tecido, e ainda assim não consegue dizer que genes estão expressos nem que células estão vivas.

Exercício 14.4 ★

Liste quatro serviços que o microbioma intestinal presta a seu hospedeiro e uma doença que se segue a sua perturbação.

Solução

Solução de Exercício 14.4.

Fermentar a fibra em ácidos graxos de cadeia curta que alimentam o cólon e o hospedeiro; sintetizar vitamina K e vitaminas do complexo B; transformar ácidos biliares e fármacos; a resistência à colonização contra patógenos; educar o sistema imune. Perturbação: a colite por Clostridioides difficile depois de antibióticos (também implicadas: a doença inflamatória intestinal e a obesidade).

Exercício 14.5 ★★

Uma amostra de $N = 20$ leituras contém espécies com $N_{i} = 10, 6, 3, 1$ . Calcule $E[S_{n}]$ para $n = 5$ pelo teorema, e a cobertura de Good.

Solução

Solução de Exercício 14.5.

$\binom{20}{5} = 15\,504$ . Espécie com $10$ : $1 - \binom{10}{5}/ 15\,504 = 1 - 252/15\,504 = 0.984$ ; com $6$ : $1 - 2002/15\,504 = 0.871$ ; com $3$ : $1 - 6188/15\,504 = 0.601$ ; com $1$ : $1 - 11\,628/15\,504 = 0.25$ . $E[S_{5}] = 2.7$ espécies. Cobertura: um singleton, $1 - 1/20 = 0.95$ .

Exercício 14.6 ★★

O cólon abriga $400\,\mathrm{g}$ de conteúdo a $10^{11}$ bactérias por grama; uma bactéria pesa $1\,\mathrm{pg}$ e seu genoma tem $4000$ genes; o intestino de uma pessoa tem $1000$ espécies. Estime a massa do microbioma e o número de genes distintos que ele carrega, e compare com os $20\,000$ do genoma humano.

Solução

Solução de Exercício 14.6.

$400\times 10^{11} = 4\times 10^{13}$ bactérias, cerca de $40\,\mathrm{g}$ . Genes: $1000$ espécies $\times$ $4000$ , descontada a sobreposição — da ordem de $3\times 10^{6}$ genes distintos, mais de cem vezes os $20\,000$ humanos.

Exercício 14.7 ★★

Explique o paradoxo do oxigênio no nódulo e como a leghemoglobina e a barreira de difusão o resolvem. Por que um nódulo é rosa, e o que significa um nódulo verde?

Solução

Solução de Exercício 14.7.

A nitrogenase é destruída pelo oxigênio, mas os bacteroides precisam respirar para fazer dezesseis ATP por N $_{2}$ . O córtex do nódulo forma uma barreira de difusão que limita a entrada de oxigênio, e a leghemoglobina, em concentração milimolar, liga o oxigênio que entra, de modo que a concentração livre fica perto de $10\,\mathrm{nM}$ enquanto o fluxo aos bacteroides é alto. O rosa é a oxileghemoglobina; um nódulo verde degradou sua leghemoglobina — ele é senescente e já não fixa.

Exercício 14.8 ★★

Uma leguminosa mutante não tem o componente dos picos de cálcio da via comum da simbiose. Preveja sua nodulação e sua micorrização, e explique o que isso diz sobre a evolução das duas simbioses.

Solução

Solução de Exercício 14.8.

Os dois falham: nem nódulos nem micorriza arbuscular, porque o pico de cálcio é o sinal compartilhado da via comum da simbiose. A via, portanto, é anterior à nodulação — ela foi construída para a simbiose fúngica quatrocentos milhões de anos atrás e recrutada pelas leguminosas para os rizóbios mais tarde.

Exercício 14.9 ★★

Descreva o experimento de sanções de Kiers e o que se preveria se a planta não conseguisse distinguir nódulos fixadores de não fixadores.

Solução

Solução de Exercício 14.9.

Kiers expôs alguns nódulos de soja a uma atmosfera de argônio e oxigênio, na qual os rizóbios não conseguiam fixar nitrogênio, enquanto os demais nódulos da planta fixavam normalmente; a planta cortou o suprimento de oxigênio aos nódulos não fixadores, e os rizóbios deles se reproduziram cerca da metade. Sem essa discriminação, os rizóbios que pulassem a custosa fixação se reproduziriam mais depressa que os fixadores, espalhar-se-iam pela população, e as plantas acabariam abrigando bactérias que nada dariam: o mutualismo desmoronaria.

Exercício 14.10 ★★★

Prove que o $E[S_{n}]$ do teorema da rarefação é uma função crescente de $n$ e alcança $S$ em $n = N$ , e mostre que, para uma espécie com $N_{i} \ll N$ e $n \ll N$ , sua probabilidade de ser vista é de cerca de $1 - (1 - n/N)^{N_{i}}$ .

Solução

Solução de Exercício 14.10.

$\binom{N-N_{i}}{n}/\binom{N}{n} = \prod_{j=0}^{n-1}(N - N_{i} - j)/(N - j)$ , com cada fator abaixo de $1$ ; passar de $n$ a $n + 1$ multiplica por mais um fator abaixo de $1$ , de modo que a probabilidade de não ver cai e a de ver sobe com $n$ ; em $n = N$ o numerador $\binom{N - N_{i}}{N}$ é zero e toda espécie está presente, dando $S$ . Para $N_{i}, n \ll N$ cada fator é de cerca de $1 - N_{i}/N$ , e o produto é de cerca de $(1 - N_{i}/N)^{n} \approx e^{-nN_{i}/N} \approx (1 - n/N)^{N_{i}}$ — a aproximação de amostragem com reposição.

Exercício 14.11 ★★★

A Wolbachia é transmitida apenas pelos ovos. Explique por que a seleção sobre ela favorece hospedeiros fêmeas, descreva a incompatibilidade citoplasmática e mostre por que ela permite a uma linhagem infectada se espalhar mesmo que a infecção tenha um custo pequeno.

Solução

Solução de Exercício 14.11.

Um macho é um beco sem saída para um simbionte que só viaja em ovos, de modo que qualquer característica que transforme machos em fêmeas, que os mate em favor de suas irmãs ou que prejudique fêmeas não infectadas eleva a transmissão do simbionte. Incompatibilidade citoplasmática: o esperma de machos infectados é modificado de modo que o zigoto morre a menos que o ovo carregue a mesma Wolbachia, que o resgata. As fêmeas não infectadas, portanto, perdem a prole que concebem com machos infectados, ao passo que as infectadas não perdem nenhuma; a vantagem cresce com a frequência da infecção, de modo que, acima de um limiar, a infecção se espalha até a fixação mesmo que as fêmeas infectadas ponham um pouco menos ovos — o custo é superado pela fração das ninhadas das fêmeas não infectadas que é destruída.

Exercício 14.12 ★★★

Usando a Proposição 14.13, explique por que os genomas dos endossimbiontes de transmissão vertical encolhem, mas os de seus parentes de vida livre não, quais genes se perdem primeiro e quais por último, e o que reverteria a tendência.

Solução

Solução de Exercício 14.12.

O endossimbionte passa por um gargalo de algumas poucas células a cada geração do hospedeiro e nunca recombina com forasteiros: a deriva fixa mutações levemente deletérias, deleções inclusive, e não há fonte de genes de reposição (a catraca de Muller). Os genes cujos produtos o hospedeiro fornece, ou que servem a uma vida livre — envoltório, motilidade, regulação, a maior parte do reparo —, não fazem falta e vão primeiro; a maquinaria de tradução e os genes que fazem aquilo de que o hospedeiro precisa (os aminoácidos essenciais na Buchnera) são mantidos por mais tempo. Os parentes de vida livre têm populações enormes, recombinação e entrada de genes, e a seleção mantém seus genomas. Reverter exigiria genes novos vindos de fora — impossível no isolamento —, de modo que os hospedeiros, em vez disso, substituem um simbionte erodido por um novo, como várias linhagens de insetos já fizeram.

14.8 Problema: o censo de um intestino

Problema 14.1

Problema de fim de semana — um microbioma intestinal contado em células, genes e calorias, sua diversidade medida e rarefeita, o orçamento de nitrogênio de uma leguminosa equilibrado contra seu açúcar, e o carbono de um recife prestado em contas, terminando nas calorias que um microbioma rende, na cobertura de uma amostra de sequenciamento e no açúcar que um campo de feijão paga por seu nitrogênio

Dados: conteúdo do cólon $400\,\mathrm{g}$ a $10^{11}$ bactérias por grama, massa celular $1\,\mathrm{pg}$ ; $1000$ espécies, $4000$ genes cada, $30\,\%$ dos genes compartilhados entre duas espécies quaisquer. Dieta: $30\,\mathrm{g}$ de fibra por dia, fermentada em ácidos graxos de cadeia curta a $10\,\mathrm{mmol}$ por grama, cada um valendo $0.9\,\mathrm{kJ}$ ; uma dieta de $9000\,\mathrm{kJ}$ . Uma amostra de sequenciamento: $N = 2000$ leituras, $S = 180$ espécies, $f_{1} = 60$ singletons; abundâncias das três espécies principais $0.30$ , $0.20$ , $0.10$ , e o resto distribuído por igual. Uma lavoura de feijão fixa $150\,\mathrm{kg}$ de N por hectare por safra e paga $8\,\mathrm{g}$ de açúcar por grama de N fixado; sua fotossíntese rende $12\,\mathrm{t}$ de açúcar por hectare por safra. Nitrogenase: $16$ ATP por N $_{2}$ . Um coral: $10^{6}$ algas por cm $^{2}$ , cada uma fixando $20\,\mathrm{pg}$ de carbono por dia, com $90\,\%$ passados ao hospedeiro; o tecido do coral respira $15\,\text{µ}\mathrm{g}$ de carbono por cm $^{2}$ por dia.

Parte I — Células e genes.

Quantas bactérias há no cólon, e quanto elas pesam?
A quantos genomas bacterianos de DNA isso corresponde, e como o total se compara ao DNA das $3\times 10^{13}$ células humanas ( $6.4\,\mathrm{pg}$ cada)?
Estime o número de genes bacterianos distintos no intestino, levando em conta a sobreposição de $30\,\%$ (conte os $70\,\%$ não compartilhados de cada espécie mais um conjunto compartilhado). Compare com $20\,000$ .
Quantos milimoles de ácidos graxos de cadeia curta a fibra rende por dia, quantos quilojoules, e que fração da dieta?
Um camundongo livre de germes precisa de $30\,\%$ mais comida. A contribuição de ácidos graxos da questão 4 basta para explicar isso? O que mais poderia explicar?
As bactérias se dividem no cólon cerca de uma vez por dia, e o conteúdo é eliminado à mesma taxa. Que estado estacionário isso implica, e o que acontece com a comunidade quando um tratamento com antibióticos mata $99.9\,\%$ das células?

Parte II — Diversidade.

Calcule a abundância relativa de cada uma das $177$ espécies menores e, em seguida, o índice de Shannon $H$ e $e^{H}$ .
Calcule o índice de Simpson $D$ e $1/D$ . Por que $1/D$ é menor que $e^{H}$ ?
A cobertura de Good da amostra; quantas leituras por mil pertencem a espécies não vistas?
Uma segunda amostra de $10\,000$ leituras do mesmo intestino dá $260$ espécies. Explique, usando o teorema da rarefação, por que isso não é uma contradição, e o que fazer antes de comparar as duas.
No teorema, qual é a probabilidade de uma espécie com $N_{i} = 1$ aparecer numa subamostra de $n = 1000$ a partir de $N = 2000$ ? E com $N_{i} = 5$ ?
Depois dos antibióticos o mesmo intestino mostra $60$ espécies, $H = 2.0$ e uma espécie com abundância $0.5$ . Calcule $e^{H}$ e $D$ e descreva a comunidade em palavras.

Parte III — As contas do nódulo.

Quanto açúcar a lavoura paga por hectare por seus $150\,\mathrm{kg}$ de N, e que fração de sua fotossíntese é isso?
A quantos mols de N $_{2}$ correspondem $150\,\mathrm{kg}$ de N, e quantos mols de ATP a nitrogenase gasta neles?
A $30$ ATP por glicose respirada, a quantos quilogramas de glicose esse ATP corresponde? Compare com o açúcar pago; para que serve o resto?
A amônia industrial custa cerca de $35\,\mathrm{MJ}$ por kg de N. Usando $16\,\mathrm{kJ}$ por grama de açúcar, compare o custo energético do nitrogênio da lavoura com o da fábrica.
Um rizóbio não fixador entra num nódulo. Se a planta o sancionar reduzindo à metade seu oxigênio, e sua reprodução cair pela metade, que fração dos rizóbios da safra seguinte são trapaceiros, se começaram em $10\,\%$ e os fixadores se reproduzem normalmente? (Uma rodada.)
Sem sanções, os trapaceiros que poupam o custo de fixar se reproduzem $20\,\%$ mais. Ao longo de dez safras, que fração são trapaceiros, partindo do mesmo início? O que a comparação mostra?

Parte IV — As contas do recife.

Quanto carbono as algas de um centímetro quadrado fixam por dia, e quanto chega ao coral?
Compare com a respiração do coral. Qual é o excedente, e para que ele é usado?
Depois do branqueamento, $95\,\%$ das algas se foram. Recalcule o carbono fornecido. Quanto tempo o coral aguenta com reservas de $300\,\text{µ}\mathrm{g}$ de carbono por cm $^{2}$ ?
O estresse é muitas vezes medido em semanas-grau de aquecimento: a soma, ao longo da estação, do excesso semanal acima do máximo de verão. Oito semanas a $+1\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ou quatro a $+2\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ dão as duas $8$ ; o branqueamento começa perto de $4$ . Qual dos dois perfis é pior, e por que a métrica ainda assim pode funcionar?
Os corais podem abrigar várias espécies de algas com limites térmicos diferentes. Proponha como um recife poderia se adaptar, e o que limita isso.
Um recife com $1\,\mathrm{km}^{2}$ de superfície viva de coral: quanto carbono suas algas fixam por dia e por ano, em toneladas?
Resuma: a fração da dieta fornecida pelo microbioma (questão 4), a cobertura da amostra de sequenciamento (questão 9) e a fração da fotossíntese que uma lavoura de feijão paga por seu nitrogênio (questão 13).

Solução

Solução de Problema 14.1.

1. $400\times 10^{11} = 4\times 10^{13}$ bactérias, $40\,\mathrm{g}$ . 2. Um genoma de $4000$ genes tem cerca de $4\,\mathrm{Mb}$ , $4.4\,\mathrm{fg}$ : $4\times 10^{13}\times 4.4\times 10^{-15} = 0.18\,\mathrm{g}$ de DNA bacteriano, contra $3\times 10^{13}\times 6.4\times 10^{-12} = 0.19\,\mathrm{g}$ de DNA humano — praticamente iguais. 3. $1000\times 0.7\times 4000 + 0.3\times 4000 \approx 2.8\times 10^{6}$ genes distintos, umas $140$ vezes os do genoma humano. 4. $30\times 10 = 300\,\mathrm{mmol}$ ; $\times 0.9 = 270\,\mathrm{kJ}$ ; $3\,\%$ da dieta. 5. Não — $3\,\%$ não explicam $30\,\%$ . Os camundongos livres de germes também absorvem com menos eficiência, têm hormônios intestinais, armazenamento de gordura e termogênese alterados e apetite diferente: o microbioma age sobre a fisiologia do hospedeiro, e não apenas como fornecedor de combustível. 6. Divisão equilibrada pela eliminação: uma população estável, com cada célula reposta diariamente. Depois de uma morte de $99.9\,\%$ , restam $4\times 10^{10}$ e dez duplicações restauram os números em cerca de dez dias — mas os sobreviventes e os de crescimento mais rápido dominam, a composição fica alterada (uma disbiose) e, na brecha, um invasor como o C. difficile pode se estabelecer. 7. As espécies menores dividem $0.4$ entre $177$ : $p = 0.00226$ cada. $H = -(0.3\ln 0.3 + 0.2\ln 0.2 + 0.1\ln 0.1 + 0.4\ln 0.00226) = 0.361 + 0.322 + 0.230 + 2.437 = 3.35$ ; $e^{H} \approx 28$ . 8. $D = 0.09 + 0.04 + 0.01 + 177\times (0.00226)^{2} = 0.141$ ; $1/D = 7.1$ . O índice de Simpson eleva as abundâncias ao quadrado, de modo que as três espécies dominantes o decidem e as raras quase não contam; o de Shannon dá mais peso às espécies raras. 9. $1 - 60/2000 = 0.97$ : cerca de $30$ leituras por mil pertencem a espécies ainda não vistas. 10. A riqueza sobe com o tamanho da amostra enquanto espécies raras continuam aparecendo; $10\,000$ leituras alcançam espécies que $2000$ não alcançam. Rarefaça a amostra grande a $2000$ leituras pelo teorema (ou por subamostragem) — ela deveria dar cerca de $180$ , se for a mesma comunidade — e compare em profundidade igual. 11. $N_{i} = 1$ : $1 - \binom{1999}{1000}/\binom{2000}{1000} = 1 - (2000 - 1000)/2000 = 0.5$ . $N_{i} = 5$ : cerca de $1 - 0.5^{5} = 0.97$ . 12. $e^{2.0} = 7.4$ espécies efetivas; $D \ge 0.5^{2} = 0.25$ , cerca de $0.27$ : uma comunidade com uma espécie dominante e algumas dezenas de menores — o intestino colapsado e de baixa diversidade em que o C. difficile se instala. 13. $150\times 8 = 1200\,\mathrm{kg}$ de açúcar por hectare, $10\,\%$ das $12\,\mathrm{t}$ fotossintetizadas. 14. $150\,000/28 = 5360$ mol de N $_{2}$ ; $16\times 5360 = 85\,700$ mol de ATP. 15. $85\,700/30 = 2860$ mol de glicose, $514\,\mathrm{kg}$ — cerca de $43\,\%$ do açúcar pago. O resto constrói e mantém os nódulos e os bacteroides, fornece os oito elétrons por N $_{2}$ como redutor, e assimila a amônia. 16. $1200\times 16 = 19\,200\,\mathrm{MJ}$ para $150\,\mathrm{kg}$ de N: $128\,\mathrm{MJ}/\mathrm{kg}$ , quase quatro vezes os $35\,\mathrm{MJ}/\mathrm{kg}$ da fábrica — mas pagos em luz do sol, no campo, sem combustível. 17. Fixadores $0.9\times 1 = 0.9$ ; trapaceiros $0.1\times 0.5 = 0.05$ ; os trapaceiros ficam em $0.05/0.95 = 5.3\,\%$ — reduzidos à metade em uma safra. 18. Trapaceiros $0.1\times 1.2^{10} = 0.62$ contra fixadores $0.9$ : $41\,\%$ depois de dez safras, rumo ao domínio. As sanções voltam a seleção contra o trapaceiro; sem elas o mutualismo se erode. 19. $10^{6}\times 20\,\mathrm{pg} = 20\,\text{µ}\mathrm{g}$ de carbono por cm $^{2}$ por dia; $18\,\text{µ}\mathrm{g}$ para o coral. 20. Respiração $15\,\text{µ}\mathrm{g}$ : excedente de $3\,\text{µ}\mathrm{g}$ por cm $^{2}$ por dia para crescimento, para a matriz orgânica da calcificação, para muco e para gametas. 21. Com $5\,\%$ das algas, $0.9\,\text{µ}\mathrm{g}$ por dia contra $15\,\text{µ}\mathrm{g}$ respirados: um déficit de $14\,\text{µ}\mathrm{g}$ por dia; $300\,\text{µ}\mathrm{g}$ de reservas duram cerca de três semanas. 22. Quatro semanas a $+2$ é pior: o dano aos fotossistemas das algas sobe abruptamente, e não linearmente, com a temperatura. A métrica ainda assim funciona como aviso porque o branqueamento integra o estresse cumulativo e os dois perfis diferem menos que a incerteza do limiar; é um índice empírico, calibrado sobre branqueamentos observados. 23. Um coral estressado pode deslocar-se rumo a espécies de algas mais tolerantes ao calor já presentes em baixa abundância, ou adquiri-las da água depois do branqueamento; as algas tolerantes dão menos carbono, de modo que o coral cresce mais devagar, e a tolerância ganha é de um ou dois graus — menos que o aquecimento projetado —, enquanto o ritmo do aquecimento supera a adaptação dos próprios corais. 24. $10^{10}$ cm $^{2}$ $\times$ $20\,\text{µ}\mathrm{g}$ $= 200\,\mathrm{kg}$ de carbono por dia, cerca de $73\,\mathrm{t}$ por ano. 25. Cerca de $3\,\%$ da dieta vindos da fermentação do microbioma; $97\,\%$ de cobertura da amostra de sequenciamento; $10\,\%$ da fotossíntese pagos pelo nitrogênio da lavoura de feijão.

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