Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

8Tráfego de membranas e endereçamento de proteínas

Uma célula do pâncreas produz uns dez milhões de moléculas de enzima digestiva por minuto, empacota-as em grânulos e as libera num ducto a um sinal vindo do intestino — sem jamais deixar solta uma molécula de tripsina no próprio citoplasma. Uma célula do fígado retira colesterol do sangue engolindo inteiras as partículas que o carregam, a uma taxa de milhares por minuto, e devolve cada receptor à superfície para a próxima. Uma proteína recém-feita destinada à mitocôndria, ao núcleo, ao lisossomo, à membrana ou ao mundo exterior chega a seu endereço entre uma dúzia de compartimentos com uma taxa de erro que envergonharia um serviço postal. Este capítulo trata do endereçamento: os sinais escritos nas proteínas, as máquinas que os leem, as vesículas que levam membrana e carga entre compartimentos, os revestimentos que moldam as vesículas e as proteínas que as fazem fundir-se com o alvo certo, e o tráfego de mão dupla — secreção para fora, endocitose para dentro — que uma célula eucarionte mantém a cada segundo de sua vida.

8.1 Sinais e endereços

Definição 8.1 (Sinais de endereçamento)

Um sinal de endereçamento é um segmento de uma proteína, ou uma modificação dela, lido por um receptor que entrega a proteína a um compartimento. O peptídeo-sinal, um trecho de $15\text{ a }30$ resíduos na extremidade amino com um cerne hidrofóbico, manda a proteína para o retículo endoplasmático enquanto ela está sendo feita; dali a rota padrão leva pelo Golgi até a membrana plasmática ou o exterior, e sinais adicionais desviam para o lisossomo (um açúcar fosforilado) ou de volta ao retículo (a sequência carboxi-terminal KDEL). Um sinal de localização nuclear, um curto trecho básico como PKKKRKV, é ligado por importinas que levam a proteína enovelada pelo poro nuclear; uma pré-sequência mitocondrial, uma hélice anfipática de $20\text{ a }50$ resíduos, é reconhecida por receptores da membrana externa e enfiada, desenovelada, pelas translocases das duas membranas; as enzimas peroxissomais terminam em SKL. As proteínas sem nenhum desses sinais ficam no citosol. Todo sinal foi descoberto do mesmo modo: deletá-lo deixa a proteína no citosol, enxertá-lo numa proteína citosólica manda essa proteína ao compartimento.

Evidência. Blobel e Dobberstein (1975) traduziram o RNA mensageiro de uma cadeia leve de anticorpo num sistema livre de células. Sem membranas o produto era cerca de vinte resíduos mais longo que a proteína secretada; com fragmentos de retículo endoplasmático acrescentados durante a tradução, o produto tinha o tamanho da secretada e ficava protegido da protease acrescentada — estava dentro das vesículas —, ao passo que membranas acrescentadas depois da tradução não faziam nada. O segmento amino-terminal extra, o peptídeo-sinal, é necessário para entrar no retículo, é removido dentro dele e só funciona enquanto a cadeia está sendo feita: a hipótese do sinal, confirmada em cada detalhe quando o receptor (a partícula de reconhecimento do sinal, Walter e Blobel, 1981) e o canal (Sec61) foram purificados. ∎

A hipótese do sinal. Um peptídeo-sinal no início da cadeia nascente é ligado pela partícula de reconhecimento do sinal, que pausa a tradução e acopla o ribossomo ao canal Sec61; a cadeia então atravessa a membrana à medida que é sintetizada, o sinal é cortado no lúmen e açúcares são acrescentados.

Proposição 8.2 (Proteínas de membrana e topologia)

Um trecho hidrofóbico de cerca de vinte resíduos no meio de uma cadeia em translocação age como sequência de parada de transferência: o canal se abre lateralmente e a libera na bicamada como hélice transmembrana, com a parte já translocada no lúmen e o resto feito para dentro do citosol. Um segundo trecho desses reinicia a translocação, e uma proteína com $n$ sinais alternados termina com $n$ hélices que atravessam a membrana. A orientação fixada no retículo nunca muda: o que dá para o lúmen do retículo dá para o lúmen do Golgi e de cada vesícula depois dele, e para o exterior da célula depois da fusão com a membrana plasmática. Daí que os açúcares, acrescentados apenas no lúmen, estejam sempre na face extracelular de uma proteína de superfície, e que a topologia de um receptor possa ser lida a partir de onde estão seus sítios de glicosilação.

Método 8.3 (Pulso–caça)

Para acompanhar uma população de moléculas recém-feitas pela célula: (1) exponha as células brevemente (o pulso, alguns minutos) a um precursor radioativo ou marcado de outro modo — leucina tritiada para proteínas; (2) substitua-o por um excesso de precursor não marcado (a caça), de modo que nenhuma marcação nova seja incorporada; (3) fixe amostras de células em intervalos e localize a marcação por autorradiografia em micrografias eletrônicas, ou isolando os compartimentos e contando; (4) represente a fração de marcação em cada compartimento contra o tempo. A ordem em que os compartimentos enchem e esvaziam é a rota; os tempos dão o tempo de residência em cada um. O laboratório de Palade (anos 1960) aplicou o método à célula acinar pancreática e encontrou a marcação no retículo rugoso aos $3\,\mathrm{min}$ , no Golgi aos $20\,\mathrm{min}$ , em vacúolos de condensação e grânulos aos $40\,\mathrm{min}$ , e no ducto depois de uma hora e de um sinal: a via secretora, disposta no tempo.

Teorema 8.4 (Compartimentos em sequência e as curvas de pulso–caça)

Seja um pulso de proteína marcada que deixa o compartimento $A$ rumo a $B$ com taxa de primeira ordem $k_{1}$ e deixa $B$ rumo a $C$ com taxa $k_{2}$ , retendo-a $C$ . Com toda a marcação em $A$ em $t = 0$ ,

A(t) = e^{-k_{1}t},\qquad B(t) = \frac{k_{1}}{k_{2} - k_{1}}\bigl(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t}\bigr), \qquad C(t) = 1 - A - B,

e a marcação em $B$ tem um pico em $t^{*} = \ln(k_{2}/k_{1})/(k_{2} - k_{1})$ . O tempo médio de residência em $A$ é $1/k_{1}$ e em $B$ é $1/k_{2}$ , seja qual for a ordem das duas taxas.

Demonstração. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = -k_{1}A$ dá a exponencial. Para $B$ , $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k_{1}A - k_{2}B = k_{1}e^{-k_{1}t} - k_{2}B$ ; tente $B = \beta(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t})$ : a derivada é $\beta(-k_{1}e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ e $-k_{2}B = \beta(-k_{2} e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ , de modo que a equação exige $\beta(k_{2} - k_{1})e^{-k_{1}t} = k_{1}e^{-k_{1}t}$ , $\beta = k_{1}/(k_{2} - k_{1})$ , e $B(0) = 0$ como se pedia. Fazendo $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = 0$ : $k_{1}e^{-k_{1}t} = k_{2}e^{-k_{2}t}$ , de onde vem $t^{*}$ . O tempo médio que uma molécula passa num compartimento do qual sai à taxa $k$ é $\int_{0}^{ \infty} t\,k e^{-kt}\,\mathrm{d}t = 1/k$ . ∎

Exemplo 8.5 (A célula de Palade em números)

Tome $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ (dez minutos no retículo) e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ (vinte no Golgi). O Golgi tem seu pico em $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , e contém então $B = 2(e^{-1.39} - e^{-0.69}) = 2(0.25 - 0.50)\cdot(-1) = 0.50$ : metade da marcação. Aos $40\,\mathrm{min}$ , $A = 0.018$ , $B = 2(0.018 - 0.135) \to 0.23$ , $C = 0.75$ : três quartos da proteína chegaram aos grânulos. As curvas observadas no laboratório de Palade têm essa forma, e ajustá-las foi como os tempos de residência foram medidos pela primeira vez.

Curvas de pulso–caça do modelo de duas taxas com k_1 = 0.1\, min-1 e k_2 = 0.05\, min-1: a marcação deixa o retículo exponencialmente, passa pelo Golgi com um pico aos 14\, min e se acumula nos grânulos. — Curvas de pulso–caça do modelo de duas taxas com $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ : a marcação deixa o retículo exponencialmente, passa pelo Golgi com um pico aos $14\,\mathrm{min}$ e se acumula nos grânulos.

8.2 O retículo endoplasmático: enovelamento, açúcares e qualidade

Definição 8.6 (N-glicosilação e controle de qualidade)

Quando a cadeia entra no lúmen, um oligossacarídeo pré-montado de catorze açúcares (duas N-acetilglicosaminas, nove manoses, três glicoses) é transferido de um carreador lipídico para asparaginas na sequência Asn-X-Ser/Thr — a N-glicosilação. As três glicoses são então aparadas uma a uma, e a aparagem é um relógio do enovelamento: uma proteína que ainda carrega uma glicose é retida pela chaperona calnexina; uma proteína cuja última glicose foi removida mas que ainda não está enovelada é reglicosilada por uma enzima que reconhece trechos hidrofóbicos expostos, e volta à calnexina — o ciclo da calnexina. As proteínas que falham repetidamente são puxadas de volta ao citosol, ubiquitinadas e destruídas pelo proteassomo: a degradação associada ao RE (ERAD). Quando as proteínas mal enoveladas se acumulam mais depressa do que podem ser enoveladas ou destruídas, sensores da membrana do retículo disparam a resposta a proteínas mal enoveladas: a tradução é retardada, os genes de chaperonas são induzidos, o retículo é expandido e, se o estresse persistir, a célula é morta. A mutação mais comum da fibrose cística ( $\Delta$ F508 no CFTR) produz um canal que funcionaria, mas se enovela devagar demais, é capturado pela ERAD e nunca chega à superfície; fármacos que o ajudam a enovelar-se são hoje um tratamento.

Uma célula acinar pancreática no microscópio eletrônico: retículo endoplasmático rugoso empilhado e cravejado de ribossomos preenche a base, o Golgi fica acima do núcleo, e grânulos secretores densos de enzima digestiva estão apinhados sob a superfície apical, à espera de um sinal.

8.3 Vesículas: brotamento, endereçamento, fusão

Definição 8.7 (Revestimentos e brotamento de vesículas)

Uma vesícula de transporte é moldada por um revestimento de proteínas montado na face citosólica de uma membrana, que curva a membrana num broto de $60\text{ a }100\,\mathrm{nm}$ , recolhe carga por meio de receptores que atravessam a membrana e é descartado depois que a vesícula se destaca. Três revestimentos servem às rotas principais: o COPII para as vesículas que deixam o retículo rumo ao Golgi, o COPI para o tráfego de volta do Golgi ao retículo e entre as cisternas do Golgi, e a clatrina — uma proteína de três pernas que polimeriza numa gaiola de hexágonos e pentágonos — para as vesículas que deixam o Golgi trans rumo aos endossomos e para a endocitose na membrana plasmática, onde proteínas adaptadoras ligam a gaiola aos receptores que estão sendo internalizados. Cada revestimento é recrutado por uma GTPase pequena (Sar1 para o COPII, Arf1 para o COPI e a clatrina) que se insere na membrana em sua forma ligada a GTP e, ao hidrolisar o GTP depois do brotamento, deixa o revestimento cair. Sinais de recuperação mantêm os compartimentos distintos: as proteínas do retículo que escapam carregando KDEL são ligadas no Golgi por um receptor e levadas de volta em vesículas COPI.

À esquerda: uma gaiola de clatrina, a rede poliédrica de unidades de três pernas que molda uma vesícula endocítica (cortada para mostrar a membrana por dentro). À direita: uma pilha de Golgi no microscópio eletrônico, um monte de cisternas achatadas com vesículas brotando das bordas.

Definição 8.8 (Endereçamento e fusão)

Uma vesícula encontra seu alvo por duas camadas de reconhecimento. As GTPases Rab — umas sessenta numa célula humana, cada uma nas membranas de um compartimento — recrutam longas proteínas de amarra que capturam uma vesícula que chegue carregando a Rab correspondente. Depois agem as SNAREs: uma v-SNARE na vesícula e t-SNAREs no alvo, proteínas helicoidais ancoradas em suas membranas, enrolam-se uma na outra das extremidades distais em direção às membranas, e a energia do feixe de quatro hélices que formam puxa as duas bicamadas até que se fundam. Cada pareamento de SNAREs é específico, uma segunda conferência do endereço. Depois da fusão o feixe é desmontado pela ATPase NSF para reúso. A fusão pode ser feita esperar por um sinal: no terminal nervoso as SNAREs são mantidas meio fechadas pela complexina até que a sinaptotagmina, ligando o cálcio que entra quando chega um potencial de ação, complete o fechamento em menos de um milissegundo — a liberação de neurotransmissor tratada no volume do 2.º ano. As neurotoxinas do tétano e do botulismo são proteases que clivam SNAREs.

Evidência. Novick e Schekman (1980) isolaram mutantes de levedura sensíveis à temperatura que paravam de secretar a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ e acumulavam proteína no compartimento em que seu defeito bloqueava — retículo, Golgi ou vesículas amontoadas sob a superfície; os $23$ genes sec definiram as etapas e, uma vez clonados, revelaram-se codificadores dos revestimentos, das GTPases e das SNAREs. Rothman reconstituiu o transporte entre cisternas do Golgi num tubo de ensaio com membranas purificadas, citosol e ATP, e a partir dele purificou a NSF e as SNAREs; as duas abordagens convergiram para as mesmas proteínas, e as máquinas de levedura e de mamífero mostraram-se as mesmas. ∎

A fusão em três etapas. Uma Rab na vesícula e uma amarra no alvo trazem as duas membranas ao alcance uma da outra; as SNAREs da vesícula e do alvo (vermelho e verde) se fecham num feixe de quatro hélices que arrasta as bicamadas uma contra a outra; elas se fundem e a carga entra no compartimento-alvo.

Proposição 8.9 (O Golgi)

O Golgi é uma pilha de quatro a oito cisternas achatadas, com a face cis voltada para o retículo e a face trans voltada para a membrana plasmática, cada cisterna abrigando um conjunto diferente de enzimas que aparam e reconstroem os açúcares das glicoproteínas que passam e acrescentam açúcares O-ligados, sulfato e fosfato. A carga avança sobretudo por maturação das cisternas: uma cisterna nova se forma na face cis a partir das vesículas que chegam, atravessa a pilha como fizeram as anteriores, e amadurece à medida que vesículas COPI levam as enzimas de cada cisterna para trás, à mais jovem que vem atrás; na face trans ela se desfaz em vesículas rumo a seus destinos. É ali que o endereçamento é decidido: as hidrolases lisossomais, marcadas no Golgi cis com manose-6-fosfato, são ligadas por seu receptor e empacotadas em vesículas de clatrina rumo ao endossomo; as proteínas de secreção regulada se agregam no pH levemente ácido em grânulos de condensação; todo o resto sai na corrente constitutiva rumo à superfície. Na doença das células I a enzima que fosforila está ausente, as hidrolases são secretadas em vez de entregues, e os lisossomos se enchem de material não digerido.

O mapa do tráfego de membranas. Para fora (verde): do retículo ao Golgi em vesículas COPII, do Golgi à superfície, seja de modo constitutivo, seja por grânulos que esperam um sinal. Para trás (vermelho): vesículas COPI devolvem proteínas do retículo que escaparam. Para baixo (laranja): as enzimas lisossomais marcadas com manose-6-fosfato vão ao endossomo e ao lisossomo. Para dentro (azul): endocitose a partir da superfície, com a maioria dos receptores reciclada.

8.4 A endocitose e o lisossomo

Definição 8.10 (Endocitose)

A endocitose mediada por receptor concentra um ligante preso a receptores de superfície em fossetas revestidas de clatrina, que se destacam (a GTPase dinamina estrangula o colo) como vesículas de cerca de $100\,\mathrm{nm}$ — mil por minuto num fibroblasto, renovando toda a membrana de superfície em uma hora. As vesículas se fundem em endossomos iniciais, cujo lúmen é acidificado até pH 6 por uma bomba de prótons; a maioria dos ligantes solta ali seus receptores, os receptores voltam à superfície em vesículas de reciclagem, e o ligante segue viagem à medida que o endossomo amadurece em endossomo tardio (pH 5.5) e se funde com um lisossomo: um compartimento a pH 4.5–5 que contém umas sessenta hidrolases — proteases, nucleases, lipases, glicosidases —, ativas só naquele pH, de modo que um vazamento para o citosol neutro faz pouco estrago. O lisossomo também digere o material da própria célula entregue pela autofagia: uma membrana dupla cresce em torno de uma porção de citoplasma ou de uma organela gasta, fecha-se num autofagossomo e se funde com o lisossomo; os produtos são devolvidos ao citosol. A autofagia é induzida pela inanição (ela recicla a própria substância da célula como energia) e limpa agregados e mitocôndrias danificadas; sua falha é implicada na neurodegeneração.

Evidência. Brown e Goldstein (anos 1970) acompanharam a lipoproteína de baixa densidade (LDL), a partícula que carrega colesterol no sangue, para dentro de fibroblastos em cultura. A LDL se ligava de modo saturável a uns $20\,000$ sítios de superfície por célula, era internalizada em minutos em fossetas revestidas, e seu colesterol era liberado nos lisossomos e desligava a síntese de colesterol da própria célula. Fibroblastos de pacientes com hipercolesterolemia familiar não ligavam LDL (receptor ausente) ou a ligavam, mas não a internalizavam (uma mutação na cauda citosólica do receptor que impede sua captura pelos adaptadores de clatrina): a doença era um defeito de endocitose, a cauda do receptor continha o sinal de internalização, e o receptor reciclado — cada um fazendo centenas de viagens de ida e volta — ficou estabelecido como o mecanismo geral de captação. ∎

Proposição 8.11 (Captação por receptores reciclados)

Seja uma célula com $R$ receptores ao todo, dos quais $S$ estão na superfície e $R - S$ dentro, a caminho de volta. Um receptor de superfície está ocupado com probabilidade $\theta = [L]/(K_{d} + [L])$ , um receptor ocupado é internalizado à taxa $k_{i}$ , e um receptor internalizado retorna à taxa $k_{r}$ . No estado estacionário o fluxo de ligante para dentro da célula é

J = \frac{R\,k_{i}k_{r}\,\theta}{k_{r} + k_{i}\theta},

que satura, à medida que a concentração de ligante sobe, em $J_{\max} = R\,k_{i}k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ : a captação de uma célula é limitada não só por seus receptores, mas pela rapidez com que ela consegue trazê-los de volta.

Demonstração. Os receptores de superfície são perdidos à taxa $k_{i}\theta S$ e recuperados à taxa $k_{r}(R - S)$ ; no estado estacionário essas taxas se equilibram, de modo que $S = R\,k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta)$ . Cada internalização carrega um ligante, logo $J = k_{i}\theta S$ , o que dá a fórmula. Quando $\theta \to 1$ o fluxo tende a $R\,k_{i}k_{r}/(k_{r} + k_{i})$ — os receptores ciclam tão depressa quanto as duas taxas permitem, com uma fração $k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ deles na superfície a cada momento. ∎

Exemplo 8.12 (Colesterol partícula a partícula)

Um fibroblasto com $R = 20\,000$ receptores de LDL, tempo de internalização de $5\,\mathrm{min}$ ( $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ ) e tempo de retorno de $10\,\mathrm{min}$ ( $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ ) capta, com LDL saturante, $J_{\max} = 20\,000\times 0.2\times 0.1/0.3 \approx 1300$ partículas por minuto, com um terço de seus receptores na superfície a cada momento; cada partícula traz umas $1500$ moléculas de colesterol, dois milhões por minuto, o bastante para construir cerca de um décimo de micrômetro quadrado de membrana. Um heterozigoto para hipercolesterolemia familiar, com metade dos receptores, capta metade; o colesterol do sangue dobra, e a doença cardíaca chega vinte anos mais cedo. As estatinas elevam $R$ privando a célula do fígado de seu próprio colesterol.

Captação de LDL por receptores reciclados, pela fórmula da proposição com k_i = 0.2\, min-1 e k_r = 0.1\, min-1: saturando com o ligante, e reduzida à metade quando metade dos receptores falta. — Captação de LDL por receptores reciclados, pela fórmula da proposição com $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ : saturando com o ligante, e reduzida à metade quando metade dos receptores falta.

Observação 8.13 (Uma membrana, muitos compartimentos)

Toda membrana do sistema secretor e endocítico é, topologicamente, uma só membrana: o lúmen do retículo é contínuo, por meio de vesículas, com o exterior da célula, e um lipídio ou uma proteína feitos no retículo podem chegar à superfície sem jamais atravessar uma bicamada. O que mantém os compartimentos distintos não são paredes, mas tráfego — empacotamento seletivo para fora, recuperação seletiva de volta e um par específico de moléculas de reconhecimento em cada fusão. Os compartimentos são estados estacionários de fluxos, como os poços de um rio, e uma célula que para de traficar perde sua geografia em poucas horas.

8.5 Exercícios

Exercício 8.1 ★

Dê o sinal e o destino de cada um: um trecho de vinte resíduos hidrofóbicos na extremidade amino; PKKKRKV; uma hélice anfipática amino-terminal; KDEL na extremidade carboxi; uma manose-6-fosfato nos açúcares.

Solução

Solução de Exercício 8.1.

Trecho hidrofóbico amino-terminal: peptídeo-sinal, rumo ao retículo endoplasmático (e, por padrão, adiante até a superfície). PKKKRKV: sinal de localização nuclear, rumo ao núcleo pelo poro. Hélice anfipática amino-terminal: pré-sequência mitocondrial, rumo à matriz mitocondrial. KDEL: recuperação do Golgi de volta ao retículo. Manose-6-fosfato: do Golgi trans rumo ao endossomo e ao lisossomo.

Exercício 8.2 ★

Descreva as três observações-chave do experimento de Blobel–Dobberstein e o que cada uma mostrou.

Solução

Solução de Exercício 8.2.

(1) Sem membranas, a cadeia traduzida era cerca de vinte resíduos mais longa que a proteína secretada: um segmento é removido durante a secreção. (2) Com membranas presentes durante a tradução, o produto tinha o tamanho maduro e ficava protegido da protease: ele entrara nas vesículas e perdera o segmento dentro delas. (3) Membranas acrescentadas depois da tradução não faziam nem uma coisa nem outra: a entrada é acoplada à síntese — é cotraducional — e o segmento, o peptídeo-sinal, só funciona numa cadeia nascente.

Exercício 8.3 ★

Nomeie o revestimento e o sentido do transporte para: do retículo ao Golgi; do Golgi ao retículo; do Golgi trans ao endossomo; da membrana plasmática ao endossomo.

Solução

Solução de Exercício 8.3.

Do retículo ao Golgi: COPII, para a frente. Do Golgi ao retículo: COPI, retrógrado. Do Golgi trans ao endossomo: clatrina com seus adaptadores, para a frente rumo ao lisossomo. Da membrana plasmática ao endossomo: clatrina, para dentro (endocitose).

Exercício 8.4 ★

Por que os açúcares de uma proteína da membrana plasmática estão sempre do lado de fora da célula?

Solução

Solução de Exercício 8.4.

Os açúcares só são acrescentados dentro do lúmen do retículo e do Golgi. A face lumenal de cada vesícula continua lumenal ao longo do brotamento e da fusão, e, quando uma vesícula se funde com a membrana plasmática, sua face lumenal se torna o exterior da célula; a orientação nunca se inverte, de modo que o que foi glicosilado por dentro acaba por fora.

Exercício 8.5 ★★

No modelo do Teorema 8.4 com $k_{1} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , determine quando a marcação do Golgi tem seu pico e quanto há ali no pico; depois, a fração nos grânulos aos $60\,\mathrm{min}$ .

Solução

Solução de Exercício 8.5.

$t^{*} = \ln(0.05/0.2)/(0.05 - 0.2) = \ln 4/0.15 = 9.2\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.2/(-0.15))(e^{-1.85} - e^{-0.46}) = 0.63$ . Aos $60\,\mathrm{min}$ , $A \approx 0$ , $B = 1.33\,(e^{-3} - e^{-12}) = 0.066$ , logo $C = 0.93$ .

Exercício 8.6 ★★

Uma proteína de membrana tem trechos hidrofóbicos de $22$ resíduos nas posições 30, 90, 150 e 210 e um peptídeo-sinal amino-terminal. Desenhe ou descreva sua topologia: quantas hélices, e para que lado dá cada segmento entre elas. Onde ela pode ser glicosilada?

Solução

Solução de Exercício 8.6.

O peptídeo-sinal põe a extremidade amino no lúmen; cada trecho hidrofóbico é alternadamente uma sequência de parada ou de início de transferência, de modo que há quatro hélices transmembrana (cerca dos resíduos 30–52, 90–112, 150–172, 210–232). Segmentos: extremidade amino lumenal; 52–90 citosólico; 112–150 lumenal; 172–210 citosólico; extremidade carboxi lumenal. Glicosilação só nos segmentos lumenais — a extremidade amino, 112–150 e a extremidade carboxi —, que se tornam extracelulares na superfície.

Exercício 8.7 ★★

Usando a Proposição 8.11 com $R = 30\,000$ , $k_{i} = 0.25\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , calcule $J_{\max}$ e a fração de receptores na superfície na saturação. Que mudança única dobraria a captação?

Solução

Solução de Exercício 8.7.

$J_{\max} = 30\,000\times 0.25\times 0.05/0.30 = 1250$ por minuto; fração na superfície $k_{r}/(k_{i} + k_{r}) = 0.05/0.30 = 0.17$ . Dobrar $R$ dobra $J$ exatamente; a taxa de retorno é o gargalo (a maioria dos receptores está dentro), e dobrar $k_{r}$ daria $30\,000\times 0.25 \times 0.1/0.35 \approx 2140$ , um fator $1.7$ .

Exercício 8.8 ★★

Preveja o destino das hidrolases lisossomais, e o fenótipo, em (a) uma célula sem o receptor de manose-6-fosfato, (b) uma célula sem a fosfotransferase que acrescenta a marca, (c) uma célula tratada com um fármaco que neutraliza o pH endossomal.

Solução

Solução de Exercício 8.8.

(a) Sem receptor: as hidrolases marcadas seguem a rota padrão e são secretadas; os lisossomos ficam sem enzimas e se enchem de material não digerido — uma doença de depósito. (b) Sem fosfotransferase: o mesmo fenótipo por outra lesão (doença das células I), com as enzimas sem marca e secretadas. (c) Endossomos neutralizados: o receptor não consegue soltar sua carga, e por isso não é reciclado e as hidrolases são mal entregues ou secretadas; a LDL e outros receptores também param de ciclar.

Exercício 8.9 ★★

A mutação JD no receptor de LDL troca uma tirosina da cauda citosólica. Células que ligam LDL normalmente não conseguem captá-la. Explique o mecanismo e preveja onde os receptores são encontrados na superfície celular em relação às fossetas revestidas.

Solução

Solução de Exercício 8.9.

A tirosina pertence ao motivo da cauda que o adaptador de clatrina reconhece; sem ela o receptor não é recolhido para as fossetas revestidas. Os receptores ligam a LDL normalmente, mas ficam espalhados de modo uniforme pela superfície, excluídos das fossetas, e o ligante permanece do lado de fora — uma doença de endereçamento, e não de ligação.

Exercício 8.10 ★★★

Resolva o modelo de pulso–caça para o caso $k_{1} = k_{2} = k$ (a fórmula do teorema é singular aí): mostre que $B(t) = kt\,e^{-kt}$ e determine o pico. Depois explique por que medir apenas a fração granular $C(t)$ não permite determinar as duas taxas separadamente.

Solução

Solução de Exercício 8.10.

Com $k_{1} = k_{2} = k$ , tente $B = kt\,e^{-kt}$ : $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k e^{-kt} - k^{2}t e^{-kt} = kA - kB$ , como se pedia, com $B(0) = 0$ . O pico está onde $1 - kt = 0$ : $t^{*} = 1/k$ , $B = e^{-1} = 0.37$ . Em geral, $C(t) = 1 - (k_{2}e^{-k_{1}t} - k_{1}e^{-k_{2}t})/(k_{2} - k_{1})$ , que é simétrica na troca de $k_{1}$ por $k_{2}$ : a curva dos grânulos sozinha não pode dizer qual dos dois compartimentos é o rápido.

Exercício 8.11 ★★★

Um fibroblasto internaliza $1000$ vesículas de clatrina de $100\,\mathrm{nm}$ de diâmetro por minuto e tem uma superfície de $3000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Quanto tempo leva para internalizar o equivalente a toda a superfície? Por que a célula não encolhe, e o que esse equilíbrio implica sobre a taxa de exocitose e sobre o volume de líquido captado por hora?

Solução

Solução de Exercício 8.11.

Cada vesícula tem área $4\pi(50\,\text{nm})^{2} = 0.031\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; mil por minuto dão $31\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{min}$ , e portanto toda a superfície em $3000/31 \approx 95\,\mathrm{min}$ . A célula não encolhe porque a membrana volta por exocitose (vesículas de reciclagem) à mesma taxa — um equilíbrio de fluxos. Cada vesícula contém $5\times 10^{-19}$ L; mil por minuto durante uma hora dão $3\times 10^{-14}$ L, cerca de $1.5\,\%$ do volume de uma célula de $2\,\mathrm{pL}$ por hora.

Exercício 8.12 ★★★

A toxina botulínica cliva uma SNARE nos terminais nervosos motores; a toxina tetânica cliva a mesma SNARE em interneurônios inibitórios da medula espinhal. Explique por que a primeira causa paralisia flácida e a segunda, paralisia espástica, e por que uma toxina que bloqueia a fusão é útil na medicina em doses mínimas.

Solução

Solução de Exercício 8.12.

A toxina botulínica age no terminal motor: nenhuma acetilcolina é liberada, o músculo não recebe comando e fica frouxo — paralisia flácida. A toxina tetânica é levada pelo axônio motor acima e passa aos interneurônios inibitórios que normalmente contêm os neurônios motores; com a SNARE deles clivada, nenhuma glicina ou GABA é liberada, os neurônios motores disparam sem oposição e todo músculo se contrai — paralisia espástica. Alguns nanogramas de toxina botulínica injetados num músculo hiperativo o silenciam localmente por meses (até que nova SNARE seja feita e o terminal se recupere): um tratamento para distonias, espasticidade, estrabismo e rugas.

8.6 Problema: o dia de uma célula pancreática

Problema 8.1

Problema de fim de semana — a produção de uma célula secretora contada em moléculas, vesículas e micrômetros quadrados, suas curvas de pulso–caça resolvidas, a captação de colesterol de uma célula do fígado calculada por receptores reciclados e um lisossomo acidificado próton a próton, terminando no instante do pico do Golgi, nas vesículas que brotam por minuto e nas partículas de LDL captadas por hora

Dados: uma célula acinar produz $10^{7}$ moléculas de enzima por minuto, cada uma de $25\,\mathrm{kDa}$ e $4\,\mathrm{nm}$ de diâmetro. As vesículas de transporte são esferas de $70\,\mathrm{nm}$ de diâmetro; um grânulo é uma esfera de $1\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Área de membrana por molécula de lipídio $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ , duas monocamadas. O retículo da célula tem área de $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Pulso–caça: $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ . Uma célula do fígado: $R = 50\,000$ receptores de LDL, $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $K_{d} = 2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ , concentração plasmática de partículas de LDL $2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ; $1500$ moléculas de colesterol por partícula. Um lisossomo: esfera de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , pH de $7.2$ a $4.7$ , capacidade de tamponamento tal que $50$ prótons precisam ser bombeados para cada um que fica livre; uma bomba de prótons move $200$ prótons por segundo.

Parte I — Produção.

Que massa de enzima a célula produz por minuto, e por dia? Compare com o conteúdo proteico da própria célula, de cerca de $300\,\mathrm{pg}$ .
Quantas moléculas de enzima cabem numa vesícula se elas preenchem $30\,\%$ de seu volume (esfera de $4\,\mathrm{nm}$ )? Quantas vesículas por minuto deixam o retículo?
Que área de membrana essas vesículas carregam por minuto, e em quanto tempo elas consumiriam todo o retículo se nada voltasse?
Quantas moléculas de lipídio são essas por minuto? O que a célula precisa fazer para manter seu retículo?
Quantas moléculas de enzima cabem num grânulo com o mesmo empacotamento, e quantos grânulos a célula enche por hora?
Uma refeição esvazia $300$ grânulos em dez minutos por fusão com a membrana apical, acrescentando a membrana deles a uma superfície de $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Por qual fator a superfície apical cresce, e o que precisa vir em seguida?

Parte II — Tempos.

Com as taxas dadas, quando a marcação do Golgi tem seu pico, e que fração está ali?
Que fração de um pulso está no retículo, no Golgi e nos grânulos aos $30\,\mathrm{min}$ ?
Tempos médios de residência nos dois compartimentos? Qual é o tempo total médio da síntese até o grânulo?
Um fármaco retarda a saída do Golgi para $k_{2} = 0.01\,\mathrm{min}^{-1}$ . Novo instante do pico e nova fração no pico; como fica o Golgi ao microscópio?
Explique por que a fração do Golgi no pico é $k_{1}/k_{2}$ elevado a uma potência (dê a potência) e, portanto, sempre menor que $1$ .
Se a etapa do retículo fosse muito mais rápida que a do Golgi, de que $B(t)$ se aproximaria? Interprete.

Parte III — Colesterol.

Calcule $\theta$ na concentração plasmática de LDL, e a captação $J$ em partículas por minuto e por hora.
Quantas moléculas de colesterol por hora? As membranas da célula contêm $5\times 10^{9}$ moléculas de colesterol; quanto tempo para substituí-las todas apenas a partir da LDL?
Calcule a fração de receptores na superfície e o número de viagens de ida e volta que cada receptor faz em suas $20\,\mathrm{h}$ de vida.
Um heterozigoto tem $R = 25\,000$ : recalcule $J$ . A LDL plasmática sobe até que a captação iguale a produção: por qual fator, se $\theta$ está bem abaixo da saturação?
Uma estatina dobra $R$ nas células do fígado do heterozigoto. O que acontece com a LDL plasmática, pelo mesmo raciocínio?
Explique por que o homozigoto sem receptor, com LDL plasmática cinco vezes a normal, está ainda pior do que a aritmética da questão 16 sozinha sugere.

Parte IV — Ácido.

Calcule o volume do lisossomo em litros e o número de prótons livres a pH $7.2$ e a pH $4.7$ .
Quantos prótons precisam ser bombeados ao todo, com o tamponamento? Quanto tempo isso leva com $50$ bombas?
A bomba move prótons para dentro contra o gradiente. Que problema elétrico surge, e como ele é resolvido (pense num contraíon)?
Por que as hidrolases só são ativas a pH 5, e o que isso protege?
Por que o receptor de LDL solta a LDL a pH 6 enquanto o receptor de manose-6-fosfato solta sua carga no mesmo pH — o que as duas proteínas precisam ter em comum?
A cloroquina é uma base fraca que atravessa membranas sem carga e fica presa depois de protonada. Por qual fator ela se concentra num lisossomo a pH $4.7$ em relação ao citosol a pH $7.2$ (a razão das concentrações de prótons), e o que isso faz ao lisossomo?
Resuma: o instante do pico do Golgi (questão 7), as vesículas que deixam o retículo por minuto (questão 2) e as partículas de LDL captadas por hora (questão 13).

Solução

Solução de Problema 8.1.

1. $10^{7}\times 25\,000\,\mathrm{Da}\times 1.66\times 10^{-24}$ g $= 0.42\,\mathrm{pg}$ por minuto, $600\,\mathrm{pg}$ por dia — o dobro de seu próprio conteúdo proteico. 2. Volume da vesícula $\tfrac{4}{3}\pi\,35^{3} = 1.8\times 10^{5}$ nm $^{3}$ , $30\,\%$ disso $5.4\times 10^{4}$ ; uma molécula de enzima $\tfrac{4}{3}\pi\,2^{3} = 34$ nm $^{3}$ : cerca de $1600$ moléculas por vesícula; $10^{7}/1600 \approx 6200$ vesículas por minuto. 3. Área $4\pi\,35^{2} = 0.0154\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ cada, $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ por minuto: os $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ do retículo em cerca de uma hora, se nada voltasse. 4. $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2} = 9.5\times 10^{7}$ nm $^{2}$ , duas monocamadas a $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ : $2.7\times 10^{8}$ lipídios por minuto. A célula devolve membrana por vesículas COPI e por reciclagem, e sintetiza lipídio para repor o que sai de vez nos grânulos. 5. Volume do grânulo $5.2\times 10^{8}$ nm $^{3}$ , $30\,\%$ disso $1.6\times 10^{8}$ : $4.7\times 10^{6}$ moléculas por grânulo; $6\times 10^{8}$ moléculas por hora enchem cerca de $130$ grânulos. 6. Cada grânulo acrescenta $\pi d^{2} = 3.1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; $300$ acrescentam $940\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ a $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ : vinte vezes mais. A membrana precisa ser recuperada por endocitose compensatória em minutos. 7. $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , $B = 0.50$ . 8. $A = e^{-3} = 0.05$ ; $B = 2(e^{-1.5} - e^{-3}) = 0.35$ ; $C = 0.60$ . 9. $10\,\mathrm{min}$ e $20\,\mathrm{min}$ ; total médio $30\,\mathrm{min}$ . 10. $t^{*} = \ln(0.1)/(-0.09) = 25.6\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.1/(-0.09))(e^{-2.56} - e^{-0.256}) = 0.77$ : o Golgi incha, abarrotado com três quartos da carga. 11. No pico, $k_{1}e^{-k_{1}t^{*}} = k_{2}e^{-k_{2}t^{*}}$ ; substituindo em $B$ obtém-se $B_{\max} = (k_{1}/k_{2})^{\,k_{2}/(k_{2} - k_{1})}$ : a potência é $k_{2}/(k_{2} - k_{1})$ . Para $k_{1} > k_{2}$ o expoente é negativo e a base é maior que $1$ ; para $k_{1} < k_{2}$ a base é menor que $1$ e o expoente é positivo — nos dois casos o valor fica abaixo de $1$ (confira: $2^{-1} = 0.5$ aqui). 12. Para $k_{1} \gg k_{2}$ , $B(t) \to e^{-k_{2}t}$ : a marcação está no Golgi de imediato e sai a $k_{2}$ — a etapa do retículo fica invisível e a curva do Golgi é um simples decaimento. 13. $\theta = 2/(2+2) = 0.5$ ; $J = 50\,000\times 0.2\times 0.1\times 0.5/(0.1 + 0.1) = 2500$ partículas por minuto, $150\,000$ por hora. 14. $1.5\times 10^{5}\times 1500 = 2.3\times 10^{8}$ moléculas de colesterol por hora; $5\times 10^{9}/2.3\times 10^{8} \approx 22$ horas. 15. Fração na superfície $k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta) = 0.5$ ; uma viagem de ida e volta leva $1/(k_{i}\theta) + 1/k_{r} = 10 + 10 = 20\,\mathrm{min}$ : cerca de $60$ viagens em vinte horas. 16. $J = 1250$ por minuto. Abaixo da saturação $J \propto R\,[L]$ , de modo que, com metade dos receptores, a LDL plasmática precisa dobrar para a mesma depuração. 17. Com $R$ de volta a $50\,000$ : a depuração se restabelece e a LDL plasmática volta rumo ao normal — o efeito da estatina. 18. Sem receptores, a LDL só é depurada por rotas inespecíficas lentas, e por isso circula por dias em vez de horas, é oxidada e é captada pelos receptores depuradores dos macrófagos, que se tornam as células espumosas das placas ateroscleróticas; e as estatinas, que funcionam induzindo receptores, não têm o que induzir. 19. $V = \tfrac{4}{3}\pi(0.25)^{3} = 0.065\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} = 6.5\times 10^{-17}$ L. A pH $7.2$ : $6.3\times 10^{-8}\times 6.5\times 10^{-17} = 4\times 10^{-24}$ mol — cerca de $2$ prótons livres. A pH $4.7$ : $2\times 10^{-5}\times 6.5\times 10^{-17} = 1.3\times 10^{-21}$ mol, cerca de $780$ . 20. $50\times 780 \approx 39\,000$ prótons; $50$ bombas a $200$ por segundo movem $10\,000$ por segundo: cerca de $4\,\mathrm{s}$ . 21. Bombear carga positiva para dentro deixa o lúmen positivo, e alguns milhares de cargas parariam a bomba; o cloreto entra por um canal (ou cátions saem) para neutralizar a carga. 22. Enzimas inativas em pH neutro não fazem mal se um lisossomo vaza ou se elas são mal endereçadas ao citosol ou à superfície: a exigência de acidez confina a digestão ao compartimento construído para ela. 23. As duas precisam carregar um sensor de pH — histidinas, cuja protonação perto de pH 6 muda a superfície de ligação: o receptor de LDL dobra um domínio sobre seu próprio sítio de ligação quando protonado, e o receptor de manose-6-fosfato perde afinidade do mesmo modo. 24. $10^{7.2 - 4.7} = 10^{2.5} \approx 300$ vezes de concentração; a base aprisionada consome prótons, eleva o pH lisossomal e inativa as hidrolases — que é como a cloroquina mata os parasitos da malária em seu vacúolo alimentar e como ela bloqueia a autofagia nos experimentos. 25. Pico do Golgi aos $14\,\mathrm{min}$ ; umas $6200$ vesículas deixam o retículo por minuto; $150\,000$ partículas de LDL captadas por hora.

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