Biology · Libro 3 · Bachelor Year 1

Biología universitaria — primer año

Biología universitaria — primer año · Bachelor Year 1

11Nucleótidos y ácidos nucleicos

Viértase etanol frío sobre una disolución de células rotas y aparecerá una nube blanca de fibras que puede enrollarse en una varilla de vidrio: es el ADN, la molécula que lleva todas las instrucciones del organismo, visible a simple vista. Dos metros de él están plegados en cada núcleo humano; está escrito por entero en un alfabeto de cuatro letras, se lee en un solo sentido y se copia separando dos hebras que encajan la una en la otra como una mano y su guante. Este capítulo describe los nucleótidos — letras, moneda energética y coenzimas a la vez —, las cadenas que forman, la doble hélice y las pruebas que la sostienen, lo que ocurre cuando se funde y se vuelve a aparear, y los ARN que llevan su mensaje al resto de la célula.

11.1 Nucleótidos

Definición 11.1 (Nucleótido)

Un nucleótido consta de tres partes: una base nitrogenada — una purina (adenina A, guanina G: dos anillos condensados) o una pirimidina (citosina C, timina T, uracilo U: un anillo) —; un azúcar de cinco carbonos, la ribosa en el ARN o la 2′'-desoxirribosa en el ADN (que carece del hidroxilo del carbono 2′2'); y de uno a tres grupos fosfato sobre el carbono 5′5' del azúcar. La base se une al carbono 1′1'; los carbonos del azúcar se numeran con prima para distinguirlos de los de la base. La base más el azúcar forman un nucleósido (adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina); con los fosfatos es un nucleótido (AMP, ADP, ATP y sus parientes).

Las partes de un nucleótido: una base sobre el carbono 1' de una pentosa y fosfatos sobre el carbono 5'. El hidroxilo del 3' es donde se unirá el nucleótido siguiente de la cadena; la posición 2' distingue el ARN (OH) del ADN (H).
Las partes de un nucleótido: una base sobre el carbono 1′1' de una pentosa y fosfatos sobre el carbono 5′5'. El hidroxilo del 3′3' es donde se unirá el nucleótido siguiente de la cadena; la posición 2′2' distingue el ARN (OH) del ADN (H).

Proposición 11.2 (Los nucleótidos desempeñan tres tareas)

Además de ser los monómeros del ADN y del ARN, los nucleótidos son la moneda energética de la célula — ATP y GTP, cuyos enlaces fosfoanhídrido (Capítulo 8) pagan la síntesis, el transporte y el movimiento —; sus coenzimas — NAD+\mathrm{NAD^+}, NADP+\mathrm{NADP^+} y FAD, que transportan electrones en la respiración y en la fotosíntesis (Capítulo 15), y la coenzima A, que transporta grupos acilo —; y sus mensajeros — el AMP cíclico, que retransmite señales hormonales dentro de las células. Todos ellos son nucleótidos de adenina o están construidos sobre ellos: la misma molécula que deletrea el mensaje alimenta su ejecución.

11.2 La cadena polinucleotídica

Definición 11.3 (Enlace fosfodiéster, polaridad)

Los nucleótidos se unen en un polinucleótido mediante enlaces fosfodiéster: el fosfato del carbono 5′5' de un nucleótido se enlaza al hidroxilo 3′3' del siguiente. La cadena tiene por tanto un esqueleto de azúcar y fosfato, uniforme y cargado negativamente (una carga por fosfato), del que las bases sobresalen como una secuencia; y tiene un sentido: un extremo 5′5' con un fosfato libre y un extremo 3′3' con un hidroxilo libre. Las secuencias se escriben y se leen de 5′→3′5' \to 3', el sentido en que se sintetizan las cadenas. El ADN (ácido desoxirribonucleico) usa desoxirribosa y las bases A, G, C, T; el ARN (ácido ribonucleico) usa ribosa y A, G, C, U.

Una cadena de cuatro nucleótidos. El fosfato 5' de cada nucleótido se une al hidroxilo 3' del que está encima por un enlace fosfodiéster; la cadena va de un extremo 5' a un extremo 3' y las bases cuelgan de un esqueleto uniforme.
Una cadena de cuatro nucleótidos. El fosfato 5′5' de cada nucleótido se une al hidroxilo 3′3' del que está encima por un enlace fosfodiéster; la cadena va de un extremo 5′5' a un extremo 3′3' y las bases cuelgan de un esqueleto uniforme.

Ejemplo 11.4 (El ARN es frágil, el ADN es duradero)

El hidroxilo 2′2' de la ribosa puede atacar al enlace fosfodiéster vecino: en un álcali suave el ARN se hidroliza a nucleótidos en cuestión de horas, mientras que el ADN, que carece de ese hidroxilo, resiste la ebullición en álcali y se ha recuperado intacto de huesos de decenas de miles de años. El uracilo del ARN es la timina sin su grupo metilo; el ADN usa timina para que la citosina, que pierde lentamente su grupo amino y se convierte en uracilo, pueda reconocerse como dañada y repararse: un uracilo en el ADN es siempre un error.

11.3 La doble hélice

Proposición 11.5 (Las reglas de Chargaff)

En el ADN de cualquier organismo la cantidad de adenina iguala a la de timina y la de guanina a la de citosina (A=TA = T, G=CG = C, y por tanto purinas == pirimidinas), mientras que el cociente (G+C)/(A+T)(G + C)/(A + T) varía de una especie a otra (del 25 %25\,\% al 75 %75\,\% de G+CG + C).

Evidencia. Chargaff (1950) hidrolizó ADN de muchos organismos y separó las bases por cromatografía, midiendo cada una por su absorción ultravioleta. Las igualdades se cumplieron dentro del error experimental para todos los ADN; el contenido en G+CG + C no, y era el mismo en todos los tejidos de un mismo organismo. ∎

Teorema 11.6 (La doble hélice de Watson y Crick)

El ADN son dos cadenas polinucleotídicas enrolladas en torno a un eje común formando una doble hélice dextrógira: los esqueletos de azúcar y fosfato por fuera y las bases dentro, planas y apiladas perpendicularmente al eje. Las cadenas son antiparalelas (una va de 5′→3′5' \to 3' hacia arriba y la otra hacia abajo) y complementarias: frente a cada A hay una T, unidas por dos enlaces de hidrógeno, y frente a cada G una C, unidas por tres; cada uno de esos pares de bases tiene la misma anchura, de modo que la hélice es uniforme sea cual sea la secuencia. En la forma B, la habitual, la hélice mide 2 nm2\,\mathrm{nm} de ancho, asciende 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par de bases y 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} por vuelta de diez pares, y muestra un surco mayor ancho y un surco menor estrecho en los que los bordes de las bases quedan expuestos a las proteínas.

Evidencia. Las imágenes de difracción de rayos X de fibras de ADN obtenidas por Franklin (1952) mostraban la cruz de una hélice con una repetición de 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} a lo largo del eje, una reflexión intensa a 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} (unidades planas apiladas) y un diámetro de 2 nm2\,\mathrm{nm}; los fosfatos, los átomos más pesados, tenían que estar fuera. Watson y Crick (1953) encontraron que una purina apareada con una pirimidina — y solo A con T y G con C — da pares de igual anchura que encajan en los 2 nm2\,\mathrm{nm} de diámetro, lo que explica las reglas de Chargaff, y que dos cadenas antiparalelas así apareadas construyen una hélice regular con las dimensiones de la fibra. El modelo predecía que cada cadena es un molde para la otra; la demostración de la replicación semiconservativa por Meselson y Stahl (recordada del volumen de bachillerato y en el Capítulo 18) lo confirmó. ∎

A la izquierda: un modelo de la doble hélice; los dos esqueletos se enrollan alrededor de los pares de bases apilados y dejan un surco mayor y un surco menor. A la derecha: esos mismos diez pares de bases desenrollados en escalera: hebras antiparalelas, pares complementarios de igual anchura, 0.34\, nm por par y 3.4\, nm por vuelta.
A la izquierda: un modelo de la doble hélice; los dos esqueletos se enrollan alrededor de los pares de bases apilados y dejan un surco mayor y un surco menor. A la derecha: esos mismos diez pares de bases desenrollados en escalera: hebras antiparalelas, pares complementarios de igual anchura, 0.34\, nm por par y 3.4\, nm por vuelta.
A la izquierda: un modelo de la doble hélice; los dos esqueletos se enrollan alrededor de los pares de bases apilados y dejan un surco mayor y un surco menor. A la derecha: esos mismos diez pares de bases desenrollados en escalera: hebras antiparalelas, pares complementarios de igual anchura, 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par y 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} por vuelta.

Ejemplo 11.7 (Leer una hebra)

Si una hebra dice 5′5'-ATGGCATTC-3′3', su compañera, escrita de 5′→3′5' \to 3', es 5′5'-GAATGCCAT-3′3': complétese cada base y después inviértase el orden. Nueve pares, 3.1 nm3.1\,\mathrm{nm} de hélice y veintidós enlaces de hidrógeno (cinco G–C y cuatro A–T). Un cromosoma humano de 2.5×1082.5 \times 10^{8} pares mide 8.5 cm8.5\,\mathrm{cm} de largo en esta forma y debe plegarse cien mil veces para caber en un núcleo (Capítulo 17).

Proposición 11.8 (Qué mantiene unida la hélice)

Los enlaces de hidrógeno entre las bases apareadas dan la especificidad; el apilamiento de las bases planas unas sobre otras — contactos de van der Waals y el efecto hidrófobo, que mantiene las bases fuera del agua — aporta la mayor parte de la estabilidad; los esqueletos, cargados negativamente, se repelen, y la hélice solo es estable en presencia de cationes (el Mg2+\mathrm{Mg^{2+}} y el Na+\mathrm{Na^+} fisiológicos, o las proteínas básicas de la cromatina) que apantallen la carga. Un par G–C, con tres enlaces de hidrógeno y un apilamiento más fuerte, aguanta mejor que un par A–T.

11.4 Fusión e hibridación

Definición 11.9 (Desnaturalización, temperatura de fusión)

El calor, o un pH extremo, separa las dos hebras del ADN: es la desnaturalización (fusión), una transición cooperativa que ocurre en unos pocos grados y cuyo punto medio es la temperatura de fusión TmT_m. Va acompañada del efecto hipercrómico: las hebras sencillas absorben alrededor de un 40 %40\,\% más de luz ultravioleta a 260 nm260\,\mathrm{nm} que esas mismas bases apiladas en una hélice. TmT_m sube con el contenido en G+CG + C (0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} por punto porcentual), con la concentración salina y con la longitud; en una sal 0.15 mol/L0.15\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}, un ADN largo con un 50 %50\,\% de G+CG + C funde cerca de 90 ∘C90\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Al enfriarse despacio, las hebras encuentran a sus complementarias y rehacen la hélice: es la renaturalización, o hibridación cuando las hebras proceden de fuentes distintas.

Curvas de fusión de dos ADN en la misma sal. La absorbancia sube un 40\,\% a medida que se separan las hebras, en unos pocos grados; el punto medio, T_m, es mayor para el ADN más rico en pares G–C.
Curvas de fusión de dos ADN en la misma sal. La absorbancia sube un 40 %40\,\% a medida que se separan las hebras, en unos pocos grados; el punto medio, TmT_m, es mayor para el ADN más rico en pares G–C.

Método 11.10 (Medida de ácidos nucleicos por absorbancia)

  1. Las bases absorben luz ultravioleta con un máximo a 260 nm260\,\mathrm{nm}. En una cubeta de 1 cm1\,\mathrm{cm}, una absorbancia de 1.01.0 corresponde a 50 µg/mL50\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de ADN bicatenario (40 µg/mL40\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de ARN, 33 µg/mL33\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de ADN monocatenario).
  2. El cociente A260/A280A_{260}/A_{280} es de 1.81.8 para el ADN puro y de 2.02.0 para el ARN puro; las proteínas absorben a 280 nm280\,\mathrm{nm} y lo rebajan.
  3. Para seguir la fusión, regístrese A260A_{260} mientras se calienta despacio; el punto medio de la curva es TmT_m y su pendiente, una medida de la homogeneidad de la muestra.
  4. Para detectar una secuencia, desnaturalícese la muestra y añádase una hebra sencilla marcada complementaria de ella (una sonda); hibrida solo donde está su complementaria, y la marca señala el lugar: en un gel, en un cromosoma, en un tejido.
ADN precipitado con etanol frío a partir de un lisado celular y enrollado en una varilla de vidrio: unos pocos miligramos de la molécula, visibles como fibras porque cada una tiene millones de pares de bases.
ADN precipitado con etanol frío a partir de un lisado celular y enrollado en una varilla de vidrio: unos pocos miligramos de la molécula, visibles como fibras porque cada una tiene millones de pares de bases.

Ejemplo 11.11 (Una sonda encuentra un gen)

Una sonda de veinte nucleótidos complementaria de un gen, a 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C} por debajo de su propia TmT_m, se une a su complementaria exacta y a nada más en tres mil millones de pares de bases: un solo desapareamiento entre veinte baja la TmT_m varios grados y el híbrido desapareado funde. La especificidad del apareamiento de bases, multiplicada por veinte posiciones, es aquello en lo que se apoya toda prueba de ADN, desde la paternidad hasta la detección de patógenos.

11.5 El ARN

Definición 11.12 (Los ARN)

El ARN suele ser monocatenario y se pliega sobre sí mismo allí donde lo permiten tramos complementarios cortos, formando horquillas, bucles y protuberancias — una estructura secundaria — que luego se compacta en una forma. Tres clases sostienen el flujo de la información genética (Capítulo 19): el ARN mensajero (ARNm), una copia de un gen que lee el ribosoma; el ARN de transferencia (ARNt), unos 75 75\, nucleótidos plegados en trébol, que lleva un aminoácido en su extremo 3′3' y un anticodón que se aparea con el mensaje; y el ARN ribosómico (ARNr), el núcleo estructural y catalítico del ribosoma, cuatro quintas partes del ARN de una célula. Muchos otros ARN regulan, cortan y guían (volumen del tercer año).

Un ARN de transferencia en su estructura secundaria en trébol: una sola hebra de unos 75 nucleótidos apareada consigo misma en cuatro brazos. El aminoácido se transporta en el extremo 3'; el anticodón, en el extremo opuesto, lee el mensaje.
Un ARN de transferencia en su estructura secundaria en trébol: una sola hebra de unos 75 nucleótidos apareada consigo misma en cuatro brazos. El aminoácido se transporta en el extremo 3′3'; el anticodón, en el extremo opuesto, lee el mensaje.

Observación 11.13 (El ARN puede ser catalizador)

Algunos ARN son enzimas (ribozimas): el enlace peptídico de todas las proteínas lo forma el ARN ribosómico, y no una proteína, y algunos ARN se cortan y se empalman a sí mismos. Una molécula que a la vez lleva información y cataliza reacciones es de lo que pudo estar hecho un primer sistema vivo; el mundo del ADN y las proteínas sería entonces una división del trabajo posterior, con el ARN conservado en su centro.

11.6 Ejercicios

Ejercicio 11.1 ★

Nómbrense las tres partes de un nucleótido y las dos diferencias entre un ribonucleótido y un desoxirribonucleótido.

Solución

Solución de Ejercicio 11.1.

Una base nitrogenada, una pentosa y de uno a tres fosfatos. ARN: ribosa (con un hidroxilo en 2′2') y uracilo; ADN: 2′2'-desoxirribosa y timina.

Ejercicio 11.2 ★

Escríbase la hebra complementaria de 5′5'-GGATCCTA-3′3' en el sentido 5′→3′5' \to 3' y cuéntense sus enlaces de hidrógeno.

Solución

Solución de Ejercicio 11.2.

5′5'-TAGGATCC-3′3'. Pares: G–C, G–C, A–T, T–A, C–G, C–G, T–A, A–T: cuatro G–C (12 enlaces) y cuatro A–T (8): 20 enlaces de hidrógeno.

Ejercicio 11.3 ★

Un ADN contiene un 22 %22\,\% de adenina. Dense los porcentajes de T, G y C, y el contenido en G+CG + C.

Solución

Solución de Ejercicio 11.3.

T, 22 %22\,\%; G y C se reparten el 56 %56\,\% restante: 28 %28\,\% cada una; G+C=56 %G + C = 56\,\%.

Ejercicio 11.4 ★

A partir de la figura de la fusión, ¿cuál es la TmT_m de un ADN con un 50 %50\,\% de G+CG + C en las mismas condiciones, y cuánto sube la absorbancia al fundirse?

Solución

Solución de Ejercicio 11.4.

Entre las dos curvas, a 0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} por punto porcentual: unos 85 ∘C85\,{}^{\circ}\mathrm{C}. La absorbancia sube un 40 %40\,\%.

Ejercicio 11.5 ★★

Calcúlense la longitud del cromosoma de E. coli (4.6×1064.6 \times 10^{6} pares de bases) en milímetros, su número de vueltas y el factor de compactación necesario para que quepa en una célula de 2 µm2\,\text{µ}\mathrm{m}.

Solución

Solución de Ejercicio 11.5.

4.6×106×0.34 nm=1.56 mm4.6 \times 10^{6}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 1.56\,\mathrm{mm}; 460 000460\,000 vueltas; 1560/2=7801560/2 = 780 veces en longitud (el cromosoma está plegado en bucles y superenrollamientos).

Ejercicio 11.6 ★★

Explíquese por qué las dos hebras del ADN deben ser antiparalelas, usando la geometría del esqueleto de azúcar y fosfato y la exigencia de que todos los pares de bases tengan la misma anchura.

Solución

Solución de Ejercicio 11.6.

Las bases se aparean con sus bordes enfrentados, y el azúcar de cada una queda del mismo lado del par solo si los dos esqueletos discurren en sentidos opuestos; con hebras paralelas los dos azúcares quedarían en bordes opuestos y la anchura del par, así como la posición del esqueleto, variarían con la secuencia. Las hebras antiparalelas con pares purina–pirimidina dan los 2 nm2\,\mathrm{nm} constantes que exige el patrón de la fibra.

Ejercicio 11.7 ★★

Una disolución de ADN tiene A260=0.35A_{260} = 0.35 en una cubeta de 1 cm1\,\mathrm{cm} y A280=0.20A_{280} = 0.20. Calcúlese la concentración y coméntese la pureza. ¿Cuántos pares de bases hay en 1 mL1\,\mathrm{mL}, si la masa media de un par es de 650 Da650\,\mathrm{Da}?

Solución

Solución de Ejercicio 11.7.

0.35×50=17.5 µg/mL0.35\times 50 = 17.5\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}. A260/A280=1.75A_{260}/A_{280} = 1.75: ADN esencialmente puro (1,8), quizá con trazas de proteína. En 1 mL1\,\mathrm{mL}: 17.5×10−6/(650×1.66×10−24)=1.6×101617.5\times 10^{-6}/(650\times 1.66\times 10^{-24}) = 1.6 \times 10^{16} pares de bases.

Ejercicio 11.8 ★★

Explíquense el efecto hipercrómico y por qué la curva de fusión de un ADN puro es abrupta mientras que la de una mezcla de ADN de muchas especies está extendida.

Solución

Solución de Ejercicio 11.8.

Las bases apiladas se protegen unas a otras y absorben menos; separar las hebras expone cada base a la luz y la absorbancia sube un 40 %40\,\%. Un ADN puro funde en unos pocos grados en torno a su única TmT_m, de forma cooperativa; una mezcla contiene ADN de muchos contenidos en G+CG + C, cada uno con su propia TmT_m, así que la suma de sus curvas se extiende a lo largo de decenas de grados.

Ejercicio 11.9 ★★

Una sonda de veinte nucleótidos tiene Tm=62 ∘CT_m = 62\,{}^{\circ}\mathrm{C} con su complementaria exacta; un desapareamiento baja la TmT_m unos 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C}. ¿A qué temperatura debería hacerse la hibridación para detectar la secuencia exacta y rechazar los desapareamientos sencillos? ¿Qué ocurre a 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C}?

Solución

Solución de Ejercicio 11.9.

Justo por debajo de 62 ∘C62\,{}^{\circ}\mathrm{C} y por encima de 57 ∘C57\,{}^{\circ}\mathrm{C}, digamos 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C}: el híbrido perfecto aguanta y el desapareado funde. A 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C} son estables híbridos con hasta tres desapareamientos y la sonda ilumina también secuencias emparentadas.

Ejercicio 11.10 ★★★

Las reglas de Chargaff se cumplen en el ADN bicatenario, pero no en el ARN ni en el ADN de ciertos virus pequeños. Explíquese qué dice cada excepción sobre la estructura de esos ácidos nucleicos.

Solución

Solución de Ejercicio 11.10.

Las reglas se siguen del apareamiento de bases entre dos hebras complementarias. El ARN, monocatenario, no tiene compañera que restrinja su composición, de modo que en general A≠UA \neq U; los virus pequeños en cuestión tienen genomas de ADN monocatenario, que tampoco tienen por qué cumplir las reglas, y ese incumplimiento fue una de las primeras pistas de que eran monocatenarios.

Ejercicio 11.11 ★★★

Dos enlaces de hidrógeno mantienen un par A–T, y sin embargo una hélice de mil pares A–T es estable a 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C}, mientras que un par aislado ni siquiera se forma. Explíquese con las ideas del Capítulo 8 (enlaces débiles, cooperatividad, apilamiento), y dígase qué implica esto para la fidelidad de una sonda.

Solución

Solución de Ejercicio 11.11.

Cada par por sí solo vale unos pocos kilojulios por mol, menos que la agitación térmica, y se forma y se rompe en microsegundos. En una hélice los pares se forman juntos: cada par se apila sobre el anterior y los primeros pares nuclean al resto, de modo que las energías se suman y la probabilidad de que se rompan todos a la vez es despreciable: es la cooperatividad. El apilamiento aporta tanto como los enlaces de hidrógeno. Para una sonda esto significa que la estabilidad crece con la longitud y cae bruscamente con cada desapareamiento, que rompe la serie cooperativa: la especificidad es una propiedad del tramo entero.

Ejercicio 11.12 ★★★

“La estructura del ADN es la explicación de la herencia.” Discútase en un párrafo: qué explica de inmediato la doble hélice (la copia, la mutación como cambio de secuencia), qué no explica por sí sola (cómo la secuencia llega a ser una proteína) y por qué el modelo de Watson y Crick se aceptó antes de cualquier prueba bioquímica.

Solución

Solución de Ejercicio 11.12.

La hélice explica la copia de inmediato: cada hebra especifica a la otra, de modo que separarlas y aparear nucleótidos nuevos en cada una da dos moléculas idénticas; una mutación es una base equivocada fijada en una copia y copiada fielmente a partir de entonces. No dice, por sí sola, cómo una secuencia de cuatro bases especifica una proteína: eso costó una década (código, ARNm, ARNt, ribosoma). El modelo se aceptó porque encajaba con todas las medidas (Chargaff, las dimensiones de rayos X, la densidad) sin dejar nada suelto, y porque su explicación de la herencia era tan económica que la alternativa — una coincidencia — resultaba inverosímil; Meselson y Stahl confirmaron después la copia que predecía.

11.7 Problema: el genoma de un virus

Problema 11.1

Problema de fin de semana — el ADN del fago λ\lambda medido, pesado, contado, fundido y empaquetado en su cápside, hasta llegar a su temperatura de fusión y a su longitud de contorno

El genoma del bacteriófago λ\lambda es un único ADN bicatenario lineal de 48 50248\,502 pares de bases con un contenido en G+CG + C del 49.9 %49.9\,\%. Está empaquetado en una cápside icosaédrica de 55 nm55\,\mathrm{nm} de diámetro interno. Tómense 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par de bases, 2.0 nm2.0\,\mathrm{nm} de diámetro de hélice, 650 Da650\,\mathrm{Da} por par de bases y Tm=81.5+16.6log⁡10[Na+]+0.41 (% G+C)−500/LT_m = 81.5 + 16.6\log_{10}[\mathrm{Na^+}] + 0.41\,(\%\,G{+}C) - 500/L en grados Celsius, con [Na+][\mathrm{Na^+}] en mol/L\mathrm{mol}/\mathrm{L} y LL la longitud en pares de bases.

Parte I — Medido y pesado.

  1. Calcúlese la longitud de contorno de la molécula en micrómetros.
  2. Calcúlese el número de vueltas de la hélice.
  3. Calcúlese su masa molar en dalton.
  4. Calcúlese la masa de una molécula en gramos.
  5. Calcúlense el número de grupos fosfato y, con ello, la carga neta de la molécula.
  6. Calcúlese el número de nucleótidos de cada base (A, T, G, C).
  7. Calcúlese el número total de enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras.

Parte II — Fundido.

  1. Calcúlese TmT_m en sodio 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}.
  2. Calcúlese TmT_m en sodio 0.01 mol/L0.01\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} y explíquese por qué la sal estabiliza la hélice.
  3. El genoma de λ\lambda contiene una región de 1000 1000\, pares con un 35 %35\,\% de G+CG + C y otra con un 62 %62\,\%. Calcúlese la TmT_m de cada región en sodio 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} y descríbase la forma de la curva de fusión de la molécula entera.
  4. Una disolución de ADN de λ\lambda tiene A260=0.50A_{260} = 0.50 antes de la fusión. ¿Cuál es su concentración, y cuánto valdrá A260A_{260} tras la fusión completa?
  5. ¿Cuántas moléculas de λ\lambda hay en 1 mL1\,\mathrm{mL} de esa disolución?
  6. Los dos extremos del genoma de λ\lambda son salientes monocatenarios de 12 nucleótidos, complementarios entre sí, por los que la molécula se circulariza en el hospedador. Calcúlese su TmT_m (úsese L=12L = 12) y dígase por qué, pese a ello, el círculo aguanta a 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} dentro de la célula.

Parte III — Empaquetado.

  1. Calcúlese el volumen del ADN como cilindro.
  2. Calcúlese el volumen interno de la cápside.
  3. ¿Qué fracción de la cápside ocupa el ADN? Compárese con el empaquetamiento más denso de cilindros paralelos (91 %91\,\%).
  4. El ADN lleva 97 00097\,000 cargas negativas dentro de una esfera de 55 nm55\,\mathrm{nm}. Explíquese qué debe acompañar al ADN dentro de la cápside, y por qué el ADN empaquetado ejerce sobre la envoltura una presión (de decenas de atmósferas) que ayuda a inyectarlo en una bacteria.
  5. La molécula debe doblarse en bucles de radio comparable al de la cápside. El ADN se resiste a doblarse por debajo de un radio de unos 50 nm50\,\mathrm{nm}. Coméntese.

Parte IV — Leído.

  1. Una hebra del genoma empieza por 5′5'-GGGCGGCGACCT-3′3'. Escríbase la hebra complementaria de 5′→3′5' \to 3'.
  2. Si un gen de 12001200 pares de bases se transcribe a un ARNm, ¿cuál es la longitud del ARNm en nucleótidos y, a 330 Da330\,\mathrm{Da} por nucleótido, su masa?
  3. El genoma tiene 75 75\, genes en 48 50248\,502 pares. ¿Qué fracción del genoma es codificante si el gen medio tiene 600600 pares? Compárese con el genoma humano (1.5 %1.5\,\%).
  4. El genoma se replica en 20 min20\,\mathrm{min} a 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} con las enzimas del hospedador. Calcúlese la velocidad en pares de bases por segundo si la replicación empieza en un origen y avanza en ambos sentidos.
  5. ¿Cuántos enlaces de hidrógeno se rompen por segundo en las dos horquillas durante la replicación (úsese la media por par de la pregunta 7)?
  6. Una mutación cambia un par G–C por uno A–T. ¿Cuánto varía la TmT_m de la molécula entera? ¿Podría detectarlo la fusión?
  7. Enúnciese el resultado: la temperatura de fusión del ADN de λ\lambda en sodio 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} y su longitud de contorno, y la compactación con la que cabe en la cápside.
Solución

Solución de Problema 11.1.

1. 48 502×0.34=16 490 nm=16.5 µm48\,502\times 0.34 = 16\,490\,\mathrm{nm} = 16.5\,\text{µ}\mathrm{m}. 2. 48 502/10=485048\,502/10 = 4850 vueltas. 3. 48 502×650=3.15×107 Da48\,502\times 650 = 3.15 \times 10^{7}\,\mathrm{Da}. 4. 3.15×107×1.66×10−24=5.2×10−17 g3.15 \times 10^{7}\times 1.66\times 10^{-24} = 5.2 \times 10^{-17}\,\mathrm{g}. 5. Dos por par: 97 00497\,004 fosfatos, carga neta −97 004 e-97\,004\,e. 6. G+C=0.499×97 004=48 405G + C = 0.499\times97\,004 = 48\,405: G=C=24 203G = C = 24\,203; A=T=24 299A = T = 24\,299. 7. 3×24 203+2×24 299=121 2073\times24\,203 + 2\times24\,299 = 121\,207. 8. 81.5+16.6×(−1)+0.41×49.9−500/48502=81.5−16.6+20.5−0.01=85.4 ∘C81.5 + 16.6\times(-1) + 0.41\times 49.9 - 500/48502 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 0.01 = 85.4\,{}^{\circ}\mathrm{C}. 9. 81.5−33.2+20.5=68.8 ∘C81.5 - 33.2 + 20.5 = 68.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Los cationes apantallan la repulsión entre los dos esqueletos cargados negativamente; con menos sal las hebras se repelen más y se separan a menor temperatura. 10. 35 %35\,\%: 81.5−16.6+14.4−0.5=78.8 ∘C81.5 - 16.6 + 14.4 - 0.5 = 78.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}; 62 %62\,\%: 81.5−16.6+25.4−0.5=89.8 ∘C81.5 - 16.6 + 25.4 - 0.5 = 89.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. La molécula entera funde por etapas: las regiones ricas en A–T se abren primero y las ricas en G–C, al final, de modo que la curva es una subida ancha con hombros y no un único escalón abrupto. 11. 0.50×50=25 µg/mL0.50\times 50 = 25\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}; tras la fusión, A260=0.70A_{260} = 0.70. 12. 25×10−6/5.2×10−17=4.8×101125\times 10^{-6}/5.2\times 10^{-17} = 4.8 \times 10^{11} moléculas. 13. 81.5−16.6+0.41×50−500/12=81.5−16.6+20.5−41.7=43.7 ∘C81.5 - 16.6 + 0.41\times 50 - 500/12 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 41.7 = 43.7\,{}^{\circ}\mathrm{C} (la fórmula es aproximada para tramos tan cortos). A 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} los extremos se aparean, pero se abrirían y se cerrarían; en la célula una enzima (la ligasa) sella covalentemente las dos mellas, y el círculo ya no depende de los doce pares. 14. π×(1.0)2×16 490=5.2×104 nm3\pi\times(1.0)^2\times16\,490 = 5.2 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 15. 43π×27.53=8.7×104 nm3\frac{4}{3}\pi\times 27.5^3 = 8.7 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 16. El 60 %60\,\%: dos tercios del empaquetamiento máximo posible de cilindros; el ADN está enrollado en espirales casi cristalinas. 17. Contraiones (poliaminas, Mg2+\mathrm{Mg^{2+}}) deben neutralizar casi toda la carga, o la repulsión no podría vencerse; la repulsión restante y la energía de flexión almacenada en las espirales apretadas empujan hacia fuera contra la envoltura, y cuando la cola se abre esa presión impulsa la primera parte del genoma dentro de la bacteria. 18. Los bucles de una cápside de 55 nm55\,\mathrm{nm} tienen radios de 10 to 25 nm10\text{ to }25\,\mathrm{nm}, por debajo de los 50 nm50\,\mathrm{nm} a los que el ADN se dobla con libertad: doblarlo cuesta energía, pagada por el motor de empaquetamiento (ATP) y almacenada como la presión de la pregunta 17. 19. 5′5'-AGGTCGCCGCCC-3′3'. 20. 12001200 nucleótidos; 1200×330=4.0×105 Da1200\times 330 = 4.0 \times 10^{5}\,\mathrm{Da}. 21. 75×600=45 00075\times 600 = 45\,000 pares, el 93 %93\,\% codificante: un genoma compacto; el genoma humano es sesenta veces menos denso en genes. 22. Dos horquillas, cada una copiando 24 25124\,251 pares en 1200 s1200\,\mathrm{s}: 20 20\, pares por segundo y horquilla (la polimerasa del hospedador puede con 1000 1000\,; el tiempo lo fija el ciclo entero, no la polimerasa). 23. 121 207/48 502=2.5121\,207/48\,502 = 2.5 enlaces por par; dos horquillas a 20 pares por segundo: 100 enlaces de hidrógeno por segundo, y otros tantos rehechos por detrás. 24. Un par entre 48 50248\,502 cambia el G+CG + C en un 0.002 %0.002\,\% y la TmT_m en 0.001 ∘C0.001\,{}^{\circ}\mathrm{C}: indetectable fundiendo la molécula entera; solo una sonda corta que abarcara el punto lo mostraría. 25. Tm=85 ∘CT_m = 85\,{}^{\circ}\mathrm{C} en sodio 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}; longitud de contorno 16.5 µm16.5\,\text{µ}\mathrm{m}, trescientas veces el diámetro de la cápside, empaquetada en ella ocupando el 60 %60\,\% de su volumen.

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