Biología universitaria — primer año · Bachelor Year 1

13Enzimas y catálisis bioquímica

Viértase agua oxigenada sobre una patata cortada y burbujeará: una sola molécula de catalasa de las células de la patata escinde cuarenta millones de moléculas de peróxido por segundo, una reacción que, abandonada a sí misma, tardaría años. El peróxido iba a descomponerse de todos modos — la reacción va cuesta abajo —, pero no en ningún tiempo útil. Todas las reacciones de la célula son así: la termodinámica dice hacia dónde puede ir, y una enzima dice si va ahora. Este capítulo describe qué le hace una enzima a una reacción, la cinética con que se miden y se comparan las enzimas, las maneras de inhibirlas y las maneras en que la célula las enciende y las apaga.

13.1 Catálisis

Definición 13.1 (Enzima, sustrato, centro activo)

Una enzima es una proteína (rara vez un ARN) que cataliza una reacción: aumenta su velocidad sin consumirse y sin alterar el equilibrio. Las moléculas sobre las que actúa son sus sustratos; se unen en el centro activo, una hendidura tapizada por unos pocos residuos, donde ocurre la química. Las enzimas son específicas — para un sustrato o una familia, para un enlace, para un estereoisómero — y se nombran por su sustrato y su reacción con el sufijo -asa (lactasa, ADN polimerasa, succinato deshidrogenasa), en seis clases: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Muchas necesitan un cofactor no proteico: un ion metálico (Zn, Mg, Fe) o una coenzima orgánica — $\mathrm{NAD^+}$ , FAD, coenzima A —, casi todas fabricadas a partir de vitaminas, que es para lo que sirven las vitaminas.

Proposición 13.2 (Lo que cambia una enzima y lo que no)

Una reacción pasa por un estado de transición, una disposición forzada de los átomos con una energía libre superior a la de reactivos y productos en la energía de activación $E_a$ ; solo reaccionan las moléculas que la agitación térmica lleva por encima de esa barrera, en una fracción proporcional a $e^{-E_a/RT}$ . Una enzima fija el estado de transición con más fuerza que el sustrato — su centro activo es complementario de la forma forzada — y así rebaja $E_a$ : rebajarla en $34\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ (lo que valen unos pocos enlaces de hidrógeno) a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplica la velocidad por $e^{34\,000/2580} \approx 10^6$ . No cambia $\Delta G$ ni la constante de equilibrio, que dependen solo de reactivos y productos: una enzima acelera por igual la reacción directa y la inversa y lleva el sistema antes al mismo equilibrio.

Energía libre a lo largo de una reacción. La enzima (rojo) rebaja la barrera del estado de transición y deja intacta la diferencia entre sustrato y producto y, por tanto, el equilibrio.

Agua oxigenada sobre una patata cortada: la catalasa de las células la escinde en agua y oxígeno cuarenta millones de veces por segundo y por molécula de enzima, y el oxígeno sale burbujeando.

Proposición 13.3 (Cómo funciona el centro activo)

Un centro activo acelera su reacción por varios medios a la vez: fija y orienta los sustratos de modo que los grupos reaccionantes se encuentren con la geometría adecuada, y sustituye así una colisión improbable por una segura; fuerza el sustrato hacia el estado de transición (ajuste inducido: la enzima se cierra en torno al sustrato, y el ajuste es óptimo para el estado de transición); sus cadenas laterales actúan como ácidos y bases y ceden y toman protones del sustrato en el momento justo (la histidina, con su p $K_a$ cercana a 7, lo hace en muchas enzimas); algunas forman un enlace covalente transitorio con el sustrato (las serina proteasas); y sus iones metálicos polarizan enlaces y estabilizan cargas. El agua queda en gran medida excluida del centro, de modo que las cargas y los enlaces de hidrógeno actúan con toda su fuerza.

Ejemplo 13.4 (Tres enzimas)

La lisozima, presente en las lágrimas y en la clara de huevo, fuerza un anillo de azúcar de la pared bacteriana hasta la forma del estado de transición y corta la cadena: una aceleración de $10^8$ veces. La anhidrasa carbónica, en los glóbulos rojos, sostiene un ion cinc que convierte el agua en un hidróxido dispuesto a atacar al $\mathrm{CO_2}$ : un millón de moléculas por segundo, la enzima más rápida después de la catalasa. La quimotripsina, en el jugo pancreático, usa una serina activada por una histidina para cortar proteínas tras los residuos aromáticos: cien por segundo, con un intermediario covalente.

13.2 Cinética enzimática

Definición 13.5 (Velocidad inicial, saturación)

La velocidad $v$ de una reacción enzimática es la cantidad de producto formada por unidad de tiempo ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , o unidades de enzima: $1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). Se mide como velocidad inicial $v_0$ , antes de que se agote el sustrato o se acumule el producto. A una concentración de enzima fija, $v_0$ sube con la concentración de sustrato $[S]$ y luego se satura en un máximo $V_{\max}$ : la enzima está totalmente ocupada y no puede ir más deprisa.

Teorema 13.6 (Michaelis–Menten)

Para una enzima $E$ que fija su sustrato de forma reversible y lo convierte,

E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_{\text{cat}}}{\longrightarrow} E + P ,

la velocidad inicial a la concentración de sustrato $[S]$ es

v_0 = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_m + [S]}, \qquad V_{\max} = k_{\text{cat}}\,[E]_{\text{tot}}, \qquad K_m = \frac{k_{-1} + k_{\text{cat}}}{k_1} .

$K_m$ , la constante de Michaelis, es la concentración de sustrato a la que la velocidad es la mitad de su máximo, y mide cuánto sustrato necesita la enzima; $k_{\text{cat}}$ , el número de recambio, es el número de moléculas de sustrato que convierte una enzima por segundo cuando está saturada; el cociente $k_{\text{cat}}/K_m$ es la eficacia catalítica, la constante de velocidad a baja concentración de sustrato, acotada superiormente por la velocidad a la que el sustrato puede llegar a la enzima por difusión, unos $10^8$ – $10^9$ $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ .

Demostración. Supóngase un estado estacionario en el que $ES$ se forma tan deprisa como desaparece (válido tras los primeros milisegundos, mientras $[S] \gg [E]$ ): $k_1[E][S] = (k_{-1} + k_{\text{cat}})[ES]$ , de modo que $[E][S] = K_m[ES]$ con la $K_m$ definida. La conservación da $[E] = [E]_{\text{tot}} - [ES]$ ; sustituyendo, $([E]_{\text{tot}} - [ES])[S] = K_m[ES]$ , y por tanto $[ES] = [E]_{\text{tot}}[S]/(K_m + [S])$ . La velocidad es $v_0 = k_{\text{cat}}[ES]$ , lo que da la fórmula; con $[S] \gg K_m$ , $v_0 \to k_{\text{cat}}[E]_{\text{tot}} = V_{\max}$ , y con $[S] = K_m$ , $v_0 = V_{\max}/2$ . ∎

A la izquierda: la hipérbola de Michaelis–Menten para K_m = 2\, mmol/ L y V_ = 1\, µ mol/ min, con los seis puntos medidos del problema de fin de semana. A la derecha: esos mismos datos como diagrama de Lineweaver–Burk, 1/v_0 frente a 1/[S]: una recta cuyas ordenadas y abscisas en el origen dan V_ y K_m. — A la izquierda: la hipérbola de Michaelis–Menten para $K_m = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ y $V_{\max} = 1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , con los seis puntos medidos del problema de fin de semana. A la derecha: esos mismos datos como diagrama de Lineweaver–Burk, $1/v_0$ frente a $1/[S]$ : una recta cuyas ordenadas y abscisas en el origen dan $V_{\max}$ y $K_m$ .

Método 13.7 (Medida de $K_m$ y $V_{\max}$ )

Prepárese una serie de concentraciones de sustrato que abarque de $K_m/4$ a $10K_m$ , con la misma concentración de enzima; síganse el producto (color, absorbancia, gas) durante el primer minuto y tómese la pendiente como $v_0$ .
Represéntese $v_0$ frente a $[S]$ : la hipérbola da una $V_{\max}$ aproximada (la meseta) y $K_m$ (la concentración correspondiente a su mitad).
Para mayor precisión, invértase: $1/v_0 = (K_m/V_{\max})(1/[S]) + 1/V_{\max}$ (Lineweaver–Burk). El corte de la recta con el eje $y$ es $1/V_{\max}$ , y con el eje $x$ es $-1/K_m$ ; su pendiente es $K_m/V_{\max}$ .
Divídase $V_{\max}$ por la concentración de enzima para obtener $k_{\text{cat}}$ ; divídase por $K_m$ para la eficacia. Repítase con un inhibidor para ver qué parámetro cambia.

Un ensayo enzimático: el producto absorbe luz y el espectrofotómetro registra su aparición segundo a segundo; la pendiente inicial es v_0. — Un ensayo enzimático: el producto absorbe luz y el espectrofotómetro registra su aparición segundo a segundo; la pendiente inicial es $v_0$ .

Ejemplo 13.8 (Enzimas comparadas)

enzima	$K_m$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ )	$k_{\text{cat}}$ ( $\mathrm{s}^{-1}$ )	$k_{\text{cat}}/K_m$ ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ )
catalasa	$2.5 \times 10^{-2}$	$4 \times 10^{7}$	$1.6 \times 10^{9}$
anhidrasa carbónica	$1.2 \times 10^{-2}$	$1 \times 10^{6}$	$8 \times 10^{7}$
quimotripsina	$1.5 \times 10^{-2}$	100	$7 \times 10^{3}$
lisozima	$6 \times 10^{-6}$	0,5	$8 \times 10^{4}$
ADN polimerasa	$1 \times 10^{-5}$	15	$1.5 \times 10^{6}$

La catalasa y la anhidrasa carbónica trabajan en el límite de difusión: toda colisión con el sustrato es productiva. La quimotripsina es lenta, pero necesita serlo: corta un enlace peptídico, tarea mucho más difícil que escindir peróxido.

13.3 Inhibición

Definición 13.9 (Inhibidores)

Un inhibidor rebaja la velocidad de una enzima. Los inhibidores irreversibles se unen covalentemente y destruyen para siempre la actividad de la enzima (los agentes nerviosos sobre la acetilcolinesterasa, la penicilina sobre la enzima que entrecruza la pared bacteriana, la aspirina sobre la enzima que fabrica las prostaglandinas). Los inhibidores reversibles se unen por enlaces débiles y pueden lavarse; según dónde se unan:

competitivos: el inhibidor se parece al sustrato y ocupa el centro activo; eleva la $K_m$ aparente (en el factor $1 + [I]/K_i$ ) y deja $V_{\max}$ sin cambios — con suficiente sustrato se lo desplaza;
no competitivos: el inhibidor se une en otro sitio y estropea la catálisis haya o no sustrato unido; rebaja $V_{\max}$ y deja $K_m$ sin cambios — ninguna cantidad de sustrato lo vence;
acompetitivos: el inhibidor se une solo al complejo $ES$ ; caen tanto $V_{\max}$ como $K_m$ .

$K_i$ , la constante de disociación del inhibidor, mide su potencia: cuanto menor, más fuerte.

Diagramas de Lineweaver–Burk con los dos inhibidores habituales. Un inhibidor competitivo hace pivotar la recta en torno a su corte con el eje y (V_ sin cambios, K_m elevada); uno no competitivo la hace pivotar en torno a su corte con el eje x (K_m sin cambios, V_ rebajada). — Diagramas de Lineweaver–Burk con los dos inhibidores habituales. Un inhibidor competitivo hace pivotar la recta en torno a su corte con el eje $y$ ( $V_{\max}$ sin cambios, $K_m$ elevada); uno no competitivo la hace pivotar en torno a su corte con el eje $x$ ( $K_m$ sin cambios, $V_{\max}$ rebajada).

Ejemplo 13.10 (La competencia como medicina)

El metanol es inofensivo hasta que la alcohol deshidrogenasa del hígado lo convierte en formaldehído y ácido fórmico, que ciegan y matan. El tratamiento es etanol: un sustrato competidor con una $K_m$ menor, que mantiene ocupada a la enzima mientras el metanol se excreta sin cambios. Las estatinas son inhibidores competitivos, semejantes al estado de transición, de la enzima que compromete el carbono al colesterol; las sulfamidas se parecen al sustrato de una enzima bacteriana que fabrica folato, que los seres humanos no fabricamos y por tanto no echamos de menos.

13.4 Regulación

Definición 13.11 (Enzimas alostéricas)

Una enzima alostérica tiene varias subunidades y, además de sus centros activos, sitios reguladores donde se unen efectores: los activadores la desplazan hacia su conformación activa y los inhibidores hacia la inactiva. Su velocidad frente a $[S]$ es sigmoide, no hiperbólica (por la cooperatividad entre los centros activos, como en la hemoglobina, Capítulo 12), de modo que un pequeño cambio de sustrato cerca de la parte abrupta cambia mucho la velocidad; los efectores desplazan la curva lateralmente (cambiando la concentración de sustrato necesaria) o hacia arriba y hacia abajo (cambiando la velocidad máxima). Las enzimas alostéricas se sitúan en los puntos de bifurcación del metabolismo, y los efectores son los propios productos de la vía y las señales energéticas de la célula (ATP, ADP, AMP).

Una enzima alostérica. La curva sigmoide hace que la velocidad sea sensible al sustrato cerca del punto medio; un activador la desplaza a la izquierda (más activa a un [S] dado) y un inhibidor a la derecha. Cerca de [S] = 3 la velocidad puede oscilar de la décima parte del máximo a nueve décimas. — Una enzima alostérica. La curva sigmoide hace que la velocidad sea sensible al sustrato cerca del punto medio; un activador la desplaza a la izquierda (más activa a un $[S]$ dado) y un inhibidor a la derecha. Cerca de $[S] = 3$ la velocidad puede oscilar de la décima parte del máximo a nueve décimas.

Proposición 13.12 (Cuatro maneras en que la célula controla una enzima)

Inhibición por retroalimentación: el producto final de una vía es un inhibidor alostérico de su primera enzima comprometida, de modo que la vía funciona solo tan deprisa como se consume el producto (la isoleucina sobre la treonina desaminasa; el ATP sobre la fosfofructoquinasa, Capítulo 15). Tiempo de respuesta: milisegundos.
Modificación covalente: una quinasa une un fosfato a una serina, una treonina o una tirosina de la enzima, una fosfatasa lo retira, y las dos formas difieren en actividad (la glucógeno fosforilasa se activa por fosforilación y la glucógeno sintasa se inactiva, ante la misma señal hormonal). De segundos a minutos; reversible; amplificable en cascadas.
Activación proteolítica: algunas enzimas se fabrican como precursores inactivos (zimógenos: tripsinógeno, pepsinógeno, los factores de la coagulación) y se activan cortando un péptido, de una vez por todas, donde y cuando hacen falta.
Cantidad: la célula fabrica más o menos enzima controlando su gen (Capítulo 20) y la degrada más deprisa o más despacio. De minutos a horas.

Ejemplo 13.13 (Isoenzimas)

La lactato deshidrogenasa existe en cinco formas, tetrámeros de dos tipos de subunidad en todas las combinaciones; la forma del corazón tiene una $K_m$ baja para el lactato y la inhibe el piruvato (oxida lactato para alimentar el ciclo de Krebs), y la forma del músculo tiene una $V_{\max}$ alta y tolera el piruvato (fabrica lactato en un esprint). El patrón de formas de la sangre revela qué órgano se ha dañado: un infarto libera la del corazón.

13.5 Temperatura y pH

Proposición 13.14 (Las enzimas y su entorno)

La velocidad de una reacción enzimática se duplica aproximadamente cada $10\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ( $Q_{10} \approx 2$ ), a medida que la energía térmica lleva más moléculas por encima de la barrera, hasta que la enzima empieza a desplegarse (entre $40\text{ to }60\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ en casi todas; $100\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ en las de las bacterias de las fuentes termales) y la velocidad se desploma. Cada enzima tiene un pH óptimo, aquel en que la ionización de sus residuos catalíticos y la de su sustrato son las adecuadas: la pepsina, en el estómago, cerca de pH 2; la tripsina, en el intestino, cerca de 8; y casi todas las enzimas intracelulares, cerca de 7. Lejos del óptimo la velocidad cae, y muy lejos la proteína se desnaturaliza. La temperatura y el pH actúan sobre la proteína; la célula mantiene ambos dentro del intervalo en que funcionan sus mil enzimas.

Ejemplo 13.15 (Una fiebre y una fuente termal)

Una fiebre de $40\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ acelera un cuarto todas las reacciones del cuerpo y empieza a desplegar las proteínas más frágiles; a $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ fallan las del encéfalo. La ADN polimerasa de una bacteria de una fuente a $75\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ resiste $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , y por eso puede someterse miles de veces al ciclo de fusión del ADN y se convirtió en la enzima de la reacción en cadena de la polimerasa (volumen del tercer año): la termoestabilidad es una propiedad de la secuencia, no de la química catalizada.

13.6 Ejercicios

Ejercicio 13.1 ★

¿Qué cambia una enzima en una reacción y qué deja sin cambiar? Ilústrese con el perfil energético.

Solución

Solución de Ejercicio 13.1.

Rebaja la energía de activación (la altura del estado de transición) y, con ella, la velocidad en ambos sentidos; deja sin cambios $\Delta G$ , la constante de equilibrio y la posición del equilibrio. En el perfil, el pico baja y los dos extremos no.

Ejercicio 13.2 ★

Defínanse $K_m$ , $V_{\max}$ , $k_{\text{cat}}$ y $k_{\text{cat}}/K_m$ , con sus unidades.

Solución

Solución de Ejercicio 13.2.

$K_m$ : concentración de sustrato a la mitad de $V_{\max}$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ ). $V_{\max}$ : velocidad con sustrato saturante ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , o $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). $k_{\text{cat}}$ : moléculas de sustrato convertidas por segundo y por enzima en saturación ( $\mathrm{s}^{-1}$ ). $k_{\text{cat}}/K_m$ : la eficacia, la constante de velocidad de segundo orden a baja concentración de sustrato ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ ).

Ejercicio 13.3 ★

A partir de la figura de Lineweaver–Burk de los inhibidores, léanse $V_{\max}$ y $K_m$ para la enzima sin inhibir y para cada inhibidor.

Solución

Solución de Ejercicio 13.3.

Sin inhibidor: ordenada en el origen 1, luego $V_{\max} = 1$ ; corte con el eje $x$ en $-0.5$ , luego $K_m = 2$ . Competitivo: $V_{\max} = 1$ , corte con el eje $x$ en $-0.25$ , $K_m = 4$ . No competitivo: ordenada 2, $V_{\max} = 0.5$ ; corte con el eje $x$ en $-0.5$ , $K_m = 2$ .

Ejercicio 13.4 ★

Nómbrense las cuatro maneras en que una célula regula la actividad de una enzima y dese la escala de tiempo de cada una.

Solución

Solución de Ejercicio 13.4.

Regulación alostérica (por retroalimentación), milisegundos; modificación covalente (fosforilación), de segundos a minutos; activación proteolítica de un zimógeno, una sola vez y a demanda; control de la cantidad por expresión génica y degradación, de minutos a horas.

Ejercicio 13.5 ★★

Una enzima tiene $K_m = 0.1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ y $V_{\max} = 50\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . Calcúlese $v_0$ para $[S] = 0.02$ , $0.1$ , $1$ y $10\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . ¿A qué $[S]$ vale $v_0 = 0.9\,V_{\max}$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 13.5.

$v_0 = 50[S]/(0.1 + [S])$ : 8,3, 25, 45,5 y $49.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . $0.9 = [S]/(0.1 + [S])$ da $[S] = 0.9\,K_m/0.1 = 0.9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Ejercicio 13.6 ★★

Rebajar $E_a$ en $20\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplica la velocidad ¿por qué factor? ¿Cuánto debe bajar $E_a$ para ganar un factor $10^{10}$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 13.6.

$e^{20\,000/2580} = e^{7.75} = 2300$ . Para $10^{10}$ : $\Delta E_a = RT\ln 10^{10} = 2.58\times 23.0 = 59\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ .

Ejercicio 13.7 ★★

$2\,\mathrm{pmol}$ de anhidrasa carbónica en $1\,\mathrm{mL}$ dan $V_{\max} = 120\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ por minuto. Calcúlense $k_{\text{cat}}$ y, con $K_m = 12\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , la eficacia. Compárese con el límite de difusión.

Solución

Solución de Ejercicio 13.7.

$V_{\max} = 0.12\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ por minuto en $1\,\mathrm{mL}$ : $1.2 \times 10^{-4}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ $= 2.0 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ de producto; enzima, $2 \times 10^{-12}\,\mathrm{mol}$ : $k_{\text{cat}} = 2\times 10^{-6}/2\times 10^{-12} = 1 \times 10^{6}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Eficacia $10^6/0.012 = 8 \times 10^{7}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , dentro de un factor diez del límite de difusión: casi todo encuentro con una molécula de sustrato es productivo.

Ejercicio 13.8 ★★

Un inhibidor competitivo a $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ duplica la $K_m$ aparente. Calcúlese $K_i$ . ¿Qué concentración de sustrato devuelve la velocidad al $90\,\%$ de $V_{\max}$ con y sin el inhibidor, si $K_m = 1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 13.8.

$1 + 2/K_i = 2$ : $K_i = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Para el $90\,\%$ : $[S] = 9K_m^{\text{ap}}$ : $9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ sin el inhibidor y $18\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ con él.

Ejercicio 13.9 ★★

Explíquese por qué la inhibición por retroalimentación actúa sobre el primer paso comprometido de una vía y no sobre el último, y por qué el inhibidor suele ser el producto final y no un intermediario.

Solución

Solución de Ejercicio 13.9.

Inhibir el primer paso comprometido detiene toda la vía de golpe y no malgasta intermediarios, que de otro modo se acumularían; el producto final es la señal que importa — su abundancia es exactamente la información de que la vía ya no hace falta —, mientras que el nivel de un intermediario no dice nada sobre la demanda.

Ejercicio 13.10 ★★★

El tripsinógeno se activa en el intestino, no en el páncreas que lo fabrica; una pequeña fracción activada antes de tiempo destruye el páncreas. Explíquense la lógica de los zimógenos, el papel de la enzima que activa el tripsinógeno y por qué el páncreas fabrica además un inhibidor de la tripsina.

Solución

Solución de Ejercicio 13.10.

Una proteasa activa en la célula que la fabrica digeriría esa célula; fabricada como zimógeno inactivo, es inofensiva hasta que la enteropeptidasa, una enzima del revestimiento intestinal, corta el tripsinógeno a tripsina en el duodeno, donde se quiere la digestión; la tripsina activa después los demás zimógenos (una cascada). Como una traza de tripsina puede iniciar la cascada antes de tiempo, el páncreas empaqueta en sus gránulos un inhibidor específico de la tripsina como seguro; el fallo de ese dispositivo es la pancreatitis.

Ejercicio 13.11 ★★★

Una enzima alostérica con $n = 3$ y semisaturación en $[S]_{0.5} = 3$ ve su curva desplazada a $[S]_{0.5} = 5.5$ por un inhibidor. Calcúlese la velocidad a $[S] = 3$ con y sin el inhibidor, y compárese con el cambio que produciría en una enzima de Michaelis–Menten un inhibidor competitivo que desplazara la $K_m$ otro tanto. ¿Qué añade la cooperatividad a la regulación?

Solución

Solución de Ejercicio 13.11.

Sin él: $3^3/(3^3 + 3^3) = 0.50$ . Con él: $27/(166 + 27) = 0.14$ : la velocidad cae al $28\,\%$ de su valor. En una enzima de Michaelis–Menten con la $K_m$ elevada de 3 a 5,5: de $3/6 = 0.50$ a $3/8.5 = 0.35$ , es decir, el $70\,\%$ . La cooperatividad hace que ese mismo desplazamiento de la curva sea más del doble de eficaz cerca del punto de trabajo: un interruptor y no un regulador de intensidad.

Ejercicio 13.12 ★★★

“Una enzima es un catalizador al que se le ha dicho qué hacer.” Discútase en un párrafo: catálisis frente a especificidad, la regulación como información añadida, y el coste de una enzima regulada frente al de un catalizador desnudo.

Solución

Solución de Ejercicio 13.12.

Un catalizador desnudo (una superficie de platino, un ácido) acelera muchas reacciones sin discriminar; una enzima acelera una reacción sobre un sustrato, y la especificidad de su centro activo es ya información sobre lo que la célula quiere que se haga. La regulación añade una segunda capa: los sitios alostéricos, los sitios de fosforilación y los péptidos de los zimógenos le dicen a la enzima cuándo y dónde actuar, según el estado de la célula. El coste es una proteína grande (cientos de residuos para un centro de una docena), un recambio más lento que el de los mejores catalizadores inorgánicos, y la maquinaria para fabricarla, modificarla y destruirla; el beneficio es una química que funciona solo donde y cuando resulta útil, que es lo que es un metabolismo.

13.7 Problema: una enzima medida

Problema 13.1

Problema de fin de semana — una esterasa ensayada a seis concentraciones de sustrato, sola y con dos inhibidores, con sus constantes extraídas y su comportamiento en la célula predicho, hasta llegar a su $K_m$ , su $V_{\max}$ y sus $K_i$

Una esterasa se ensaya en $1.0\,\mathrm{mL}$ a $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , pH 7,5, con $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ de enzima. Las velocidades iniciales ( $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ) a seis concentraciones de sustrato, sola y en presencia de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ del inhibidor I o de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ del inhibidor J:

$[S]$ ( $\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ )	0,5	1	2	5	10	20
$v_0$ , sin inhibidor	0,200	0,333	0,500	0,714	0,833	0,909
$v_0$ , con I	0,111	0,200	0,333	0,556	0,714	0,833
$v_0$ , con J	0,100	0,167	0,250	0,357	0,417	0,455

Parte I — La enzima sola.

Calcúlense $1/[S]$ y $1/v_0$ para los seis puntos sin inhibidor.
Muéstrese que los puntos se sitúan sobre una recta y hállense su pendiente y su ordenada en el origen.
Dedúzcanse $V_{\max}$ y $K_m$ .
Compruébese con la ecuación de Michaelis–Menten para $[S] = 5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .
Calcúlense la cantidad de enzima del ensayo (moles) y $k_{\text{cat}}$ en $\mathrm{s}^{-1}$ .
Calcúlese $k_{\text{cat}}/K_m$ y compárese con el límite de difusión.
¿A qué concentración de sustrato trabaja la enzima al $95\,\%$ de $V_{\max}$ ?

Parte II — El inhibidor I.

Calcúlese $1/v_0$ para los seis puntos con I y hállense la pendiente y la ordenada en el origen de su recta.
Dedúzcanse la $V_{\max}$ y la $K_m$ aparentes con I.
¿Qué parámetro ha cambiado? Clasifíquese el inhibidor.
Calcúlese $K_i$ a partir de $K_m^{\text{ap}} = K_m(1 + [I]/K_i)$ .
Con $[S] = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , ¿qué concentración de I reduce la velocidad a la mitad? ¿Y con $[S] = 20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?
Propóngase qué podría ser I, estructuralmente, y dónde se une.

Parte III — El inhibidor J.

Calcúlense la pendiente y la ordenada en el origen de la recta con J y dedúzcanse la $V_{\max}$ y la $K_m$ aparentes.
Clasifíquese J y calcúlese su $K_i$ a partir de $V_{\max}^{\text{ap}} = V_{\max}/(1 + [J]/K_i)$ .
Explíquese por qué subir el sustrato no puede vencer a J.
Duplicar la concentración de enzima en presencia de J, ¿qué le hace a la velocidad? ¿Y en presencia de I?

Parte IV — En la célula. La célula mantiene el sustrato a $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ y la enzima a $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ en un volumen de $1000\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , con $Q_{10} = 2$ .

Calcúlese la velocidad en la célula (moléculas de producto por segundo en toda la célula).
El producto se necesita a razón de $3 \times 10^{6}\,$ moléculas por segundo. ¿En qué factor debe elevar la célula la velocidad, y de qué dos maneras podría hacerlo?
El producto es un inhibidor competitivo de la enzima con $K_i = 0.2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , y se acumula hasta $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calcúlese entonces la velocidad y coméntese qué se consigue con ello.
Una quinasa fosforila la enzima, lo que rebaja su $K_m$ a $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calcúlese la velocidad a $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de sustrato antes y después.
El pH óptimo de la enzima es 7,5 y su actividad se reduce a la mitad a pH 6,5. Un lisosoma está a pH 5. Predígase cualitativamente su actividad allí y explíquese en términos de residuos ionizables.
Una mutación sustituye por alanina la histidina del centro activo. Predíganse el efecto sobre $K_m$ y sobre $k_{\text{cat}}$ , con una razón para cada uno.
Explíquese por qué la célula mantiene el sustrato cerca de $K_m$ y no muy por encima.
Enúnciese el resultado: $K_m$ , $V_{\max}$ y $k_{\text{cat}}$ de la esterasa, y el tipo y la $K_i$ de cada inhibidor.

Solución

Solución de Problema 13.1.

1. $1/[S]$ : 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05. $1/v_0$ : 5,0, 3,0, 2,0, 1,4, 1,2, 1,1. 2. Cada paso de $1/[S]$ cambia $1/v_0$ en proporción: pendiente $(5.0 - 1.1)/(2 - 0.05) = 2.0$ ; ordenada en el origen $1.0$ . 3. $V_{\max} = 1/1.0 = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ; $K_m = \text{pendiente}\times V_{\max} = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 4. $1.0\times 5/(2 + 5) = 0.714$ : lo medido. 5. $10 \times 10^{-9}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}\times1 \times 10^{-3}\,\mathrm{L} = 1 \times 10^{-11}\,\mathrm{mol}$ ; $V_{\max} = 1 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min} = 1.67 \times 10^{-8}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ ; $k_{\text{cat}} = 1.67\times 10^{-8}/10^{-11} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ . 6. $1670/(2\times 10^{-3}) = 8.3 \times 10^{5}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ : mil veces por debajo del límite de difusión; solo una colisión de cada mil es productiva. 7. $0.95 = [S]/(2 + [S])$ : $[S] = 19\,K_m = 38\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 8. $1/v_0$ : 9,0, 5,0, 3,0, 1,8, 1,4, 1,2. Pendiente $(9.0 - 1.2)/1.95 = 4.0$ ; ordenada en el origen $1.0$ . 9. $V_{\max}^{\text{ap}} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (sin cambios); $K_m^{\text{ap}} = 4.0\times 1.0 = 4.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 10. $K_m$ duplicada, $V_{\max}$ sin cambios: competitivo. 11. $4 = 2(1 + 1/K_i)$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 12. Con el inhibidor, $v = V_{\max}[S]/(K_m(1 + [I]/K_i) + [S])$ ; reducir la velocidad a la mitad exige $K_m(1 + [I]/K_i) + [S] = 2(K_m + [S])$ , es decir, $[I] = K_i(K_m + [S])/K_m$ : a $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 1\times 4/2 = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; a $20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 22/2 = 11\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Cuanto más sustrato, más inhibidor hace falta. 13. Una molécula parecida al sustrato (o a su estado de transición) — un análogo de éster que no puede hidrolizarse — que se une en el centro activo. 14. $1/v_0$ : 10,0, 6,0, 4,0, 2,8, 2,4, 2,2; pendiente $4.0$ , ordenada en el origen $2.0$ : $V_{\max}^{\text{ap}} = 0.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , $K_m^{\text{ap}} = 4.0\times 0.5 = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 15. $V_{\max}$ reducida a la mitad, $K_m$ sin cambios: no competitivo; $2 = 1 + 1/K_i$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 16. J se une a un sitio distinto del centro activo, tanto a la enzima libre como al $ES$ , con la misma afinidad: el sustrato no compite con él, y a cualquier $[S]$ la mitad de las moléculas de enzima quedan inactivadas. 17. Con J la velocidad se duplica (la mitad del doble de enzima sigue activa); con I también se duplica (la velocidad es proporcional a la enzima a cualquier $[S]$ ): duplicar la enzima nunca distingue a los inhibidores. 18. Velocidad a $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $V_{\max}[S]/(K_m + [S])$ con $V_{\max} = k_{\text{cat}}[E]$ : por litro, $1670\times 10^{-8} = 1.67 \times 10^{-5}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; $\times 0.5/2.5 = 3.3 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $\times 2^{1.2} = 2.3$ : $7.7 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; en $1 \times 10^{-12}\,\mathrm{L}$ : $7.7 \times 10^{-18}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ $= 4.6 \times 10^{6}$ moléculas por segundo. 19. No hace falta subirla: la velocidad ( $4.6 \times 10^{6}$ ) supera la demanda ( $3 \times 10^{6}$ ); si tuviera que subir, la célula podría elevar el sustrato, fosforilar la enzima para rebajar su $K_m$ , o fabricar más enzima. 20. $K_m^{\text{ap}} = 2(1 + 0.4/0.2) = 6\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ : la velocidad queda en $\times 0.5/6.5$ en vez de $0.5/2.5$ : el $38\,\%$ de antes, $1.8 \times 10^{6}$ por segundo; el producto estrangula su propia síntesis por debajo de la demanda, de modo que se consume y su nivel cae, lo que libera a la enzima: un suministro que se autorregula. 21. Antes: $0.5/2.5 = 0.20$ de $V_{\max}$ ; después: $0.5/0.9 = 0.56$ : casi el triple. 22. Casi nula: a pH 5 la histidina del centro activo está protonada y no puede actuar como base, y los residuos ácidos del centro quedan neutralizados; el estado de ionización de la enzima, y quizá su plegamiento, son los equivocados. Está hecha para el citosol, no para el lisosoma. 23. $K_m$ cambia poco (la unión se debe sobre todo al resto del centro); $k_{\text{cat}}$ se desploma en órdenes de magnitud, ya que la histidina era la base catalítica que activaba el agua o la serina. 24. Cerca de $K_m$ la velocidad responde a los cambios de sustrato (pendiente cercana a $V_{\max}/2K_m$ ); muy por encima, la enzima está saturada y es insensible, y el exceso de sustrato sería una carga osmótica y química. Trabajar cerca de $K_m$ hace que la vía sea controlable por el suministro. 25. $K_m = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $V_{\max} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (con $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ de enzima), $k_{\text{cat}} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ ; I es competitivo, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; J es no competitivo, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

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