Biología universitaria — primer año · Bachelor Year 1

5La célula: unidad de vida

En 1665 Robert Hooke puso una lámina de corcho bajo una lente y la vio dividida en cajitas que llamó celdas, por los cuartos de un monasterio. Diez años después un pañero holandés, Antoni van Leeuwenhoek, que tallaba sus propias lentes hasta un aumento que nadie más alcanzaba, vio seres vivos nadando en una gota de agua de charca, en el raspado de sus dientes y en su propio semen. Hizo falta otro siglo y medio para enunciar lo que ambos habían visto: que todo organismo está hecho de células y que toda célula procede de una célula. Este capítulo enuncia la teoría celular y sus pruebas, contrasta las dos clases de célula y describe los instrumentos — los microscopios, la centrífuga, el frasco de cultivo — que nos permiten ver las células, desmontarlas y mantenerlas vivas fuera de un organismo.

5.1 La teoría celular

Definición 5.1 (Célula)

Una célula es la unidad más pequeña de materia viva: un volumen de citoplasma acuoso delimitado por una membrana plasmática, que contiene el material genético (ADN) y la maquinaria que lo expresa, capaz de tomar nutrientes, transformar energía, mantener su propia organización y, cuando las condiciones lo permiten, dividirse en dos células.

Proposición 5.2 (La teoría celular)

Todo organismo está hecho de una o más células, y la célula es la unidad de estructura y de función de los seres vivos (Schleiden y Schwann, 1838–1839).
Toda célula procede de una célula preexistente por división (Virchow, 1855: omnis cellula e cellula); no hay generación espontánea.
El material hereditario pasa de célula a célula en la división, de modo que la continuidad de la vida es la continuidad de las células.

Evidencia. El corcho de Hooke (1665) y las secciones vegetales de Grew y Malpighi mostraron los tejidos vegetales como conjuntos de cámaras; las lentes de Leeuwenhoek (década de 1670) mostraron organismos unicelulares, células sanguíneas y espermatozoides. Dos siglos de lentes cada vez mejores encontraron células en todos los tejidos examinados, tanto animales como vegetales, una vez que Schwann reconoció células nucleadas en el cartílago y en los embriones. La división se observó directamente en algas y en embriones, y Virchow no encontró ningún tejido, sano o enfermo, cuyas células no procedieran de otras células. Los matraces de cuello de cisne de Pasteur (1861) — caldos que se mantenían estériles durante meses cuando el polvo no podía llegar hasta ellos, y que hervían de vida en pocos días cuando sí podía — cerraron la cuestión de la generación espontánea. El tercer enunciado es obra de finales del siglo XIX, que siguió los cromosomas a lo largo de la división (Capítulo 18). ∎

A la izquierda: el dibujo del corcho de Hooke en Micrographia (1665), las primeras células jamás representadas — las paredes vacías de células muertas, vistas en dos orientaciones. A la derecha: Antoni van Leeuwenhoek, retratado por Jan Verkolje hacia 1680, cuyos microscopios de una sola lente mostraron por primera vez células vivas. — A la izquierda: el dibujo del corcho de Hooke en *Micrographia* (1665), las primeras células jamás representadas — las paredes vacías de células muertas, vistas en dos orientaciones. A la derecha: Antoni van Leeuwenhoek, retratado por Jan Verkolje hacia 1680, cuyos microscopios de una sola lente mostraron por primera vez células vivas.

Ejemplo 5.3 (Una célula, muchas células)

Una bacteria, una levadura o una ameba son organismos enteros de una sola célula, que lo hacen todo — alimentarse, moverse, dividirse — en unos pocos micrómetros. Un ser humano son unos $3 \times 10^{13}$ células de doscientas clases, ninguna de las cuales podría vivir sola en una charca y cada una de las cuales desciende por divisiones ininterrumpidas de un único óvulo fecundado. El conejo del Capítulo 2 y el roble del Capítulo 3 son la misma teoría aplicada dos veces.

5.2 Dos clases de célula

Definición 5.4 (Células procariotas y eucariotas)

Una célula procariota (bacterias, arqueas) no tiene núcleo: su ADN, por lo general un único cromosoma circular, se aloja en una región del citoplasma llamada nucleoide, y no tiene compartimentos delimitados por membranas. Es pequeña ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) y está delimitada por una membrana plasmática y, por fuera de ella, una pared celular. Una célula eucariota (protistas, hongos, plantas, animales) guarda su ADN, en forma de varios cromosomas lineales, dentro de un núcleo delimitado por una doble membrana, y divide su citoplasma en orgánulos delimitados por membranas (Capítulo 6). Es mayor ( $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) y tiene un esqueleto interno de filamentos proteicos.

Una bacteria (Escherichia coli) abierta. Sin núcleo y sin orgánulos: un cromosoma circular laxamente plegado en el citoplasma entre miles de ribosomas, una pared por fuera de la membrana plasmática, flagelos para nadar y pili para adherirse. Longitud: unos 2\, µ m. — Una bacteria (*Escherichia coli*) abierta. Sin núcleo y sin orgánulos: un cromosoma circular laxamente plegado en el citoplasma entre miles de ribosomas, una pared por fuera de la membrana plasmática, flagelos para nadar y pili para adherirse. Longitud: unos $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Escherichia coli al microscopio electrónico de barrido (la barra al pie de la imagen mide 2\, µ m). Bastones de 2\, µ m de largo, mil de los cuales cabrían a lo ancho de un milímetro; una sola célula se divide cada veinte minutos en un medio rico. Imagen: NIAID, dominio público. — *Escherichia coli* al microscopio electrónico de barrido (la barra al pie de la imagen mide $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ). Bastones de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de largo, mil de los cuales cabrían a lo ancho de un milímetro; una sola célula se divide cada veinte minutos en un medio rico. Imagen: NIAID, dominio público.

Proposición 5.5 (La célula bacteriana)

E. coli, la bacteria modelo, es un bastón de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de largo y $0.8\,\text{µ}\mathrm{m}$ de ancho: un volumen de aproximadamente $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ que alberga un cromosoma de $4.6 \times 10^{6}$ pares de bases ( $1.5\,\mathrm{mm}$ de ADN plegado diez mil veces), unos $20\,000$ ribosomas, unos pocos millones de moléculas de proteína de $2000$ clases distintas y, a menudo, uno o varios plásmidos: pequeñas moléculas circulares de ADN que llevan genes adicionales. Su envoltura es, de dentro afuera, la membrana plasmática, una pared delgada de peptidoglucano (una malla de cadenas de azúcar entrecruzadas por péptidos cortos, que resiste la presión interna de la célula) y una membrana externa. Las bacterias con una pared gruesa de peptidoglucano y sin membrana externa retienen el cristal violeta de la tinción de Gram (grampositivas); las que tienen una pared delgada bajo una membrana externa lo pierden (gramnegativas, como E. coli). Los flagelos giran como hélices; los pili fijan la célula a las superficies y a otras células.

Método 5.6 (La tinción de Gram)

Fíjese por calor una extensión fina de bacterias a un porta.
Tíñase con cristal violeta (todas las células quedan moradas) y después con yodo, que forma un complejo voluminoso con el colorante dentro de las células.
Enjuáguese con alcohol: el peptidoglucano grueso de las células grampositivas se contrae y atrapa el complejo; la pared delgada de las gramnegativas, una vez que el alcohol ha disuelto la membrana externa, lo deja escapar.
Contrastíñase con un colorante rosa (safranina): las células grampositivas aparecen moradas y las gramnegativas, rosas. El resultado predice la estructura de la pared y, con ella, la sensibilidad a muchos antibióticos.

Los tamaños de las cosas, en escala logarítmica, y los instrumentos que los resuelven. Las bacterias se sitúan justo por encima del límite del microscopio óptico; la célula eucariota es diez veces mayor en cada dimensión, mil veces en volumen.

Ejemplo 5.7 (Por qué la célula eucariota está compartimentada)

Una célula de $20\,\text{µ}\mathrm{m}$ tiene mil veces el volumen de una bacteria, pero solo cien veces su superficie de membrana (Proposición 1.6). Las membranas son el lugar donde una célula aloja sus cadenas transductoras de energía y sus sistemas de transporte; el eucariota recupera superficie plegando membranas en su interior — la membrana interna de una mitocondria, las láminas del retículo endoplasmático — y gana, además, cámaras separadas en las que químicas incompatibles (la digestión en el lisosoma, la síntesis en el citosol) pueden funcionar una junto a otra.

5.3 Ver las células: la microscopía

Definición 5.8 (Aumento y resolución)

Un microscopio aumenta (agranda la imagen) y resuelve (separa puntos vecinos). Solo lo segundo limita lo que puede verse: el poder de resolución es la menor distancia $d$ entre dos puntos que siguen apareciendo distintos,

d = \frac{0.61\,\lambda}{\mathrm{NA}},

donde $\lambda$ es la longitud de onda de la iluminación y $\mathrm{NA}$ la apertura numérica del objetivo (el seno de su semiángulo de captación de luz por el índice de refracción del medio, como mucho $1.4$ con aceite). Aumentar más allá del poder de resolución agranda el borrón, no el detalle.

Proposición 5.9 (Microscopios ópticos y electrónicos)

Con luz visible ( $\lambda \approx 550\,\mathrm{nm}$ ) y $\mathrm{NA} = 1.4$ , el microscopio óptico resuelve $0.24\,\text{µ}\mathrm{m}$ : células, núcleos, cloroplastos, mitocondrias como puntos, bacterias como bastones, y muestras vivas en movimiento. El contraste en una célula transparente se obtiene por tinción (que suele matarla), por contraste de fases (que convierte diferencias de índice de refracción en diferencias de brillo) o por fluorescencia (marcando una molécula con un colorante o una proteína fluorescente y captando solo su luz). El microscopio electrónico usa electrones de unos pocos picómetros de longitud de onda; su resolución práctica, limitada por sus lentes, es de unos $0.2\,\mathrm{nm}$ en transmisión (TEM: los electrones atraviesan una sección de $50\,\mathrm{nm}$ de espesor teñida con metales pesados, lo que da la estructura interna de los orgánulos) y de unos nanómetros en barrido (SEM: un haz que recorre una superficie recubierta de metal, lo que da su relieve en profundidad). La microscopía electrónica exige vacío y muestras muertas, fijadas y deshidratadas.

El microscopio óptico compuesto: el objetivo forma una imagen intermedia agrandada e invertida, que el ocular vuelve a aumentar para el ojo. Lo que fija cuánto puede resolverse es la apertura numérica del objetivo, no el aumento total.

Un microscopio óptico compuesto: lámpara y condensador bajo la platina, un revólver de objetivos por encima, oculares binoculares. Resolución de 0.2\, µ m, aumento de hasta 1000\,, con muestras vivas posibles. — Un microscopio óptico compuesto: lámpara y condensador bajo la platina, un revólver de objetivos por encima, oculares binoculares. Resolución de $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ , aumento de hasta $1000\,$ , con muestras vivas posibles.

Método 5.10 (Elección del instrumento)

Para seguir un proceso vivo (una división celular, un movimiento, una proteína fluorescente que pasa de un compartimento a otro): microscopía óptica, de contraste de fases o de fluorescencia, sobre células sin fijar.
Para contar e identificar células en un tejido: una preparación fijada, seccionada y teñida al microscopio óptico.
Para ver la estructura interna de un orgánulo, de una membrana o de un virus: microscopía electrónica de transmisión de secciones finas, o de partículas con tinción negativa.
Para ver el relieve de la superficie de una célula o de un tejido: microscopía electrónica de barrido.
Para localizar una proteína: inmunofluorescencia (óptica) o marcaje con inmunooro (electrónica), con un anticuerpo contra ella.

Ejemplo 5.11 (Una bacteria y una mitocondria)

Al microscopio óptico con $1000\times$ , una célula de E. coli es un bastón de $2\,\mathrm{mm}$ de largo a escala de la retina, sin interior visible; una mitocondria es un punto en el límite de la resolución. En una sección de TEM esa misma bacteria muestra sus dos membranas, su pared, su nucleoide como una región pálida y fibrosa y sus ribosomas como granos oscuros; la mitocondria muestra su doble membrana y los pliegues de la interna. Ninguna de las dos está viva.

5.4 Desmontar las células y mantenerlas vivas

Definición 5.12 (Fraccionamiento celular)

El fraccionamiento celular separa los componentes de una célula para estudiarlos. El tejido se homogeneiza — se rompen las células en un tampón frío e isotónico por molienda o cizalladura, dejando intactos los orgánulos — y el homogeneizado se somete a una centrifugación diferencial: una serie de giros de fuerza y duración crecientes, cada uno de los cuales sedimenta las partículas mayores y más densas que quedan en suspensión. Cada fracción se identifica por su aspecto al microscopio electrónico y por enzimas marcadoras, actividades que se sabe que residen en un solo compartimento.

Centrifugación diferencial de un homogeneizado. Cada giro sedimenta lo que es mayor o más denso que lo que el anterior dejó en suspensión: primero los núcleos, luego las mitocondrias, luego los fragmentos de membrana y, por último, el citosol soluble. Las enzimas marcadoras indican a dónde ha ido cada orgánulo.

Fracciones tras giros sucesivos: los sedimentos de núcleos, mitocondrias y microsomas, cada uno bajo su sobrenadante aclarado.

Proposición 5.13 (Sedimentación)

Una partícula esférica de radio $r$ y densidad $\rho_p$ en un fluido de densidad $\rho_f$ y viscosidad $\eta$ , en un campo centrífugo $g_c$ (un múltiplo de $g$ ), sedimenta a la velocidad estacionaria

v = \frac{2}{9}\,\frac{r^2\,(\rho_p - \rho_f)\,g_c}{\eta}

(ley de Stokes). La velocidad crece con el cuadrado del radio: un núcleo de $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ cae cien veces más deprisa que una mitocondria de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , que a su vez cae mil veces más deprisa que un ribosoma de $15\,\mathrm{nm}$ . Por eso un mismo tubo los separa a velocidades crecientes.

Demostración. A velocidad estacionaria, el rozamiento de Stokes, $6\pi\eta r v$ , equilibra el peso neto de la partícula en el fluido, $\frac{4}{3}\pi r^3(\rho_p - \rho_f)g_c$ ; despejando $v$ se obtiene la fórmula. ∎

Definición 5.14 (Cultivo celular)

El cultivo celular mantiene las células vivas y dividiéndose fuera del organismo, en un medio estéril que aporta nutrientes, sales, factores de crecimiento y, para las células animales, una superficie a la que adherirse, a la temperatura del organismo. Las bacterias y las levaduras crecen en medios sencillos y se duplican en minutos u horas; las células animales tomadas de un tejido (cultivos primarios) se dividen un número limitado de veces, mientras que las líneas celulares derivadas de tumores o de células transformadas se dividen indefinidamente. El cultivo convierte a la célula en un objeto experimental: un solo tipo, un solo medio, una variable cada vez.

Ejemplo 5.15 (Una curva de crecimiento)

Un matraz de E. coli en un medio rico a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : una latencia de media hora y después crecimiento exponencial — el recuento se duplica cada $20\,\mathrm{min}$ , de modo que $N = N_0\,2^{t/20}$ — hasta que se agota un nutriente o se acumulan desechos y el cultivo alcanza una meseta cercana a $10^9$ células por mililitro. A partir de una sola célula, $2^{30} \approx 10^9$ células en diez horas. La misma curva, con un tiempo de duplicación de un día, describe un cultivo de células humanas.

5.5 Ejercicios

Ejercicio 5.1 ★

Enúncense las tres proposiciones de la teoría celular y nómbrese una prueba de cada una.

Solución

Solución de Ejercicio 5.1.

Todos los organismos están hechos de células (todos los tejidos examinados al microscopio, vegetales y animales, las muestran); toda célula procede de una célula (división observada en embriones y algas; los matraces de Pasteur excluyen la generación espontánea); el material hereditario pasa en la división (cromosomas seguidos a lo largo de la mitosis).

Ejercicio 5.2 ★

Enumérense cuatro diferencias entre una célula procariota y una eucariota.

Solución

Solución de Ejercicio 5.2.

Núcleo (ausente / presente), orgánulos delimitados por membrana (ausentes / presentes), cromosoma (uno circular / varios lineales), tamaño ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ / $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ), pared celular de peptidoglucano (bacterias) / de celulosa, de quitina o ninguna, citoesqueleto (rudimentario / elaborado).

Ejercicio 5.3 ★

A partir de la figura de la escala de tamaños, ¿cuántas bacterias puestas una tras otra abarcan un huevo de rana? ¿Y cuántas células animales?

Solución

Solución de Ejercicio 5.3.

$1\,\mathrm{mm}/1\,\text{µ}\mathrm{m} = 1000$ bacterias; $1000/20 = 50$ células animales.

Ejercicio 5.4 ★

¿Por qué un microscopio óptico de $2000\times$ no muestra más detalle que uno de $1000\times$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 5.4.

La resolución depende de la longitud de onda y de la apertura numérica, no del aumento; más allá de unos $1000\times$ la imagen agranda el borrón del límite de difracción ( $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) sin separar nada nuevo.

Ejercicio 5.5 ★★

Calcúlese el poder de resolución de un objetivo de $\mathrm{NA} = 0.65$ con luz verde ( $550\,\mathrm{nm}$ ) y con luz azul ( $450\,\mathrm{nm}$ ). ¿Puede resolver dos bacterias separadas $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ? ¿Y dos ribosomas separados $30\,\mathrm{nm}$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 5.5.

$0.61\times 550/0.65 = 516\,\mathrm{nm}$ ; en azul, $422\,\mathrm{nm}$ . Dos bacterias separadas $500\,\mathrm{nm}$ : apenas, con luz azul; ribosomas separados $30\,\mathrm{nm}$ : no, por un factor quince.

Ejercicio 5.6 ★★

Una tinción de Gram de un cultivo mixto muestra cocos morados y bastones rosas. ¿Qué dice cada color sobre la pared celular? ¿Cuál de los dos es E. coli?

Solución

Solución de Ejercicio 5.6.

Moradas: pared gruesa de peptidoglucano que retiene el complejo cristal violeta–yodo, sin membrana externa (grampositivas). Rosas: peptidoglucano delgado bajo una membrana externa, con el colorante lavado y el contraste aplicado (gramnegativas). E. coli es un bastón gramnegativo: los bastones rosas.

Ejercicio 5.7 ★★

Con la ley de Stokes, $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ y $\rho_p - \rho_f = 100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ , calcúlense la velocidad de sedimentación de una mitocondria ( $r = 0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) a $10\,000\,g$ y el tiempo que tarda en caer $5\,\mathrm{cm}$ . Repítase para un núcleo ( $r = 4\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) a $1000\,g$ .

Solución

Solución de Ejercicio 5.7.

Mitocondria: $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81\times 10^4/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $92\,\mathrm{s}$ . Núcleo a $1000\,g$ : $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $14\,\mathrm{s}$ .

Ejercicio 5.8 ★★

Las actividades marcadoras de un homogeneizado son: succinato deshidrogenasa, $80\,\%$ en el sedimento 2, $15\,\%$ en el sedimento 1 y $5\,\%$ en el sobrenadante; lactato deshidrogenasa, $95\,\%$ en el sobrenadante final. Interprétese cada cifra, incluido el $15\,\%$ del sedimento 1.

Solución

Solución de Ejercicio 5.8.

La succinato deshidrogenasa es mitocondrial: el $80\,\%$ de las mitocondrias están en el sedimento 2; el $15\,\%$ del sedimento 1 son mitocondrias atrapadas en células enteras y restos, o arrastradas con los núcleos; el $5\,\%$ del sobrenadante procede de mitocondrias rotas durante la homogeneización. La lactato deshidrogenasa es citosólica y soluble: se queda en el sobrenadante final.

Ejercicio 5.9 ★★

¿Qué microscopio se usaría para (a) observar cómo un glóbulo blanco engulle una bacteria, (b) contar las mitocondrias en una sección de músculo, (c) ver los poros de una envoltura nuclear, (d) ver la forma de la superficie de un grano de polen? Justifíquese cada elección.

Solución

Solución de Ejercicio 5.9.

(a) Microscopía óptica de contraste de fases sobre células vivas (el proceso dura minutos y necesita células vivas). (b) Microscopía óptica de una sección teñida, o TEM para mayor seguridad (las mitocondrias están en el límite óptico). (c) TEM (los poros miden $100\,\mathrm{nm}$ ). (d) SEM (relieve de la superficie).

Ejercicio 5.10 ★★★

Los matraces de Pasteur: un caldo hervido en un matraz de cuello de cisne se mantiene limpio indefinidamente; inclinado de modo que el caldo toque el polvo del cuello, se enturbia en dos días. Explíquese qué excluye cada observación y qué demuestra la pareja, y dígase por qué hervir en un matraz sellado no había zanjado la cuestión.

Solución

Solución de Ejercicio 5.10.

El matraz limpio excluye que el propio aire, o el propio caldo hervido, genere vida: el aire entra libremente por el cuello abierto. El matraz turbio, tras el contacto con el polvo, muestra que lo que el cuello había retenido — partículas del aire — es la fuente de los organismos. Juntos demuestran que los microbios proceden de microbios transportados por el polvo. Un matraz hervido y sellado dejaba abierta la objeción de que el sellado había excluido el aire que una “fuerza vital” necesitaba; el cuello de cisne admite el aire y solo excluye el polvo.

Ejercicio 5.11 ★★★

Un cultivo de E. coli parte de $10^3$ células por mililitro y se duplica cada $25\,\mathrm{min}$ . ¿Cuándo alcanza $10^8$ por mililitro? Si cada célula tiene una masa de $1\,\mathrm{pg}$ , ¿cuál es la masa bacteriana de un litro en ese momento, y por qué se detiene el crecimiento poco después incluso con glucosa en exceso?

Solución

Solución de Ejercicio 5.11.

$10^5 = 2^{n}$ da $n = 16.6$ duplicaciones, es decir, $415\,\mathrm{min}$ , unas $7\,\mathrm{h}$ . $10^8\times 10^3\,\mathrm{mL}\times1\,\mathrm{pg} = 0.1\,\mathrm{g}$ por litro. El crecimiento se detiene porque se vuelven limitantes el oxígeno (que el medio solo puede aportar a razón de unos pocos miligramos por litro), un mineral o la acumulación de ácidos y desechos, no la glucosa.

Ejercicio 5.12 ★★★

“La célula eucariota es una bacteria que aprendió a plegarse.” Discútase en un párrafo, usando la relación superficie/volumen, las membranas de los orgánulos y lo que permiten los compartimentos.

Solución

Solución de Ejercicio 5.12.

Una célula diez veces mayor en cada dimensión tiene la décima parte de superficie de membrana por unidad de volumen; como las membranas alojan la maquinaria transductora de energía y de transporte, la célula grande pasaría hambre. El eucariota multiplica la membrana plegándola en su interior (retículo endoplasmático, membrana mitocondrial interna, tilacoides) y con ello crea además compartimentos cerrados en los que procesos incompatibles — digestión ácida, química oxidativa, almacenamiento del ADN — funcionan por separado en sus propias condiciones. La imagen es acertada en lo que toca a las membranas, e incompleta: el eucariota ganó además un citoesqueleto y un núcleo, y sus mitocondrias descienden de bacterias engullidas, no de pliegues.

5.6 Problema: fraccionar un hígado

Problema 5.1

Problema de fin de semana — diez gramos de hígado de rata desmontados por centrifugación: sedimentos, marcadores, ley de Stokes y el balance de una enzima, hasta llegar al factor de purificación de la fracción mitocondrial

Se homogeneizan $10\,\mathrm{g}$ de hígado de rata en $50\,\mathrm{mL}$ de sacarosa isotónica fría y se centrifugan en tres etapas: $1000\,g$ durante $10\,\mathrm{min}$ (sedimento 1), $10\,000\,g$ durante $20\,\mathrm{min}$ (sedimento 2) y $100\,000\,g$ durante $60\,\mathrm{min}$ (sedimento 3), dejando el sobrenadante final. Se miden el contenido de proteína y dos actividades enzimáticas en el homogeneizado y en cada fracción:

fracción	proteína (mg)	succinato deshidrogenasa (U)	lactato deshidrogenasa (U)
homogeneizado	2000	100	400
sedimento 1	500	15	20
sedimento 2	200	60	12
sedimento 3	300	5	8
sobrenadante final	950	4	350

Tómense $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ para el medio, un recorrido de sedimentación de $5\,\mathrm{cm}$ y $g = 9.81\,\mathrm{m}/\mathrm{s}^{2}$ .

Parte I — Qué hay en cada sitio.

Nómbrese el orgánulo principal de cada sedimento.
¿Por qué debe ser frío e isotónico el medio de homogeneización?
¿De qué compartimento es marcadora la succinato deshidrogenasa? ¿Y de cuál la lactato deshidrogenasa?
Calcúlese la recuperación de proteína: la suma sobre las fracciones como porcentaje del homogeneizado. Coméntese.
Calcúlese del mismo modo la recuperación de cada actividad enzimática.
Calcúlense el contenido de proteína por gramo de hígado y la fracción de la masa fresca del hígado que es proteína.

Parte II — La ley de Stokes. Mitocondrias: radio $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , exceso de densidad $100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ . Núcleos: radio $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ , mismo exceso. Ribosomas: radio $12\,\mathrm{nm}$ , exceso de densidad $600\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ .

Calcúlense la velocidad de sedimentación de una mitocondria a $10\,000\,g$ y el tiempo que tarda en recorrer $5\,\mathrm{cm}$ . ¿Bastan $20\,\mathrm{min}$ ?
Calcúlese la distancia que recorre una mitocondria durante el primer giro ( $1000\,g$ , $10\,\mathrm{min}$ ). ¿Qué fracción de las mitocondrias, repartidas uniformemente al principio, quedaría sedimentada en la primera etapa?
Compárese con el $15\,\%$ de succinato deshidrogenasa hallado en el sedimento 1. ¿Qué más puede arrastrar mitocondrias al sedimento 1?
Calcúlese el tiempo que tarda un núcleo en recorrer $5\,\mathrm{cm}$ a $1000\,g$ .
Calcúlese el tiempo que tarda un ribosoma en recorrer $5\,\mathrm{cm}$ a $100\,000\,g$ . ¿Sedimentaría un ribosoma a $10\,000\,g$ en $20\,\mathrm{min}$ ?
Explíquese por qué la secuencia de giros va en fuerza creciente y por qué cada etapa debe durar lo bastante, pero no demasiado.

Parte III — Actividad específica y purificación. La actividad específica de una enzima en una fracción es su actividad por miligramo de proteína. El factor de purificación de una fracción para una enzima es su actividad específica dividida por la del homogeneizado; el rendimiento es la actividad de la fracción dividida por la del homogeneizado.

Calcúlese la actividad específica de la succinato deshidrogenasa en el homogeneizado y en cada fracción.
Calcúlense el factor de purificación y el rendimiento de la succinato deshidrogenasa en el sedimento 2.
Calcúlese el factor de purificación de la succinato deshidrogenasa en el sedimento 3 e interprétese su valor.
Calcúlense la actividad específica de la lactato deshidrogenasa en el homogeneizado y en el sobrenadante final, y el factor de purificación y el rendimiento correspondientes.
¿Por qué el factor de purificación de la enzima citosólica es menor que el de la enzima mitocondrial, aunque su rendimiento sea mayor?
El sedimento 2 contiene $12\,\mathrm{U}$ de lactato deshidrogenasa. ¿Es la enzima en parte mitocondrial? Propóngase una explicación mejor y un modo de comprobarla.
¿Qué fracción de la proteína del hígado es mitocondrial, si toda la succinato deshidrogenasa es mitocondrial y el sedimento 2 tiene una pureza del $60\,\%$ ? (Indicación: úsense la actividad específica de las mitocondrias puras, deducida del sedimento 2, y la actividad total.)

Parte IV — Comprobar las fracciones.

El sedimento 2 se examina por microscopía electrónica: ¿qué instrumento y qué preparación, y qué debería verse?
¿Cómo se comprobaría si el sedimento 1 contiene células enteras, y qué se haría si se encontraran muchas?
El sedimento 2 se resuspende y se deposita sobre un gradiente de densidad de sacarosa, y luego se centrifuga hasta que cada partícula se detiene donde su densidad iguala a la del medio. Las mitocondrias forman banda a $1.18\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , los lisosomas a $1.22\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ y los peroxisomas a $1.24\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . Explíquese por qué funciona esta separación cuando la centrifugación diferencial no podía lograrla.
La actividad de la fosfatasa ácida del sedimento 2 sube bruscamente al añadir un detergente al ensayo. Explíquese, y dígase qué indica esto sobre el estado de los lisosomas del sedimento.
Un estudiante homogeneiza en agua pura en vez de en sacarosa isotónica. Predígase el efecto sobre el sedimento 2 y sobre la distribución de la succinato deshidrogenasa y la fosfatasa ácida.
Resúmase el resultado: el factor de purificación y el rendimiento de la fracción mitocondrial, y qué limita a cada uno.

Solución

Solución de Problema 5.1.

1. Sedimento 1: núcleos (y células enteras, restos). Sedimento 2: mitocondrias (con lisosomas y peroxisomas). Sedimento 3: microsomas (fragmentos de retículo endoplasmático) y ribosomas. 2. El frío frena las enzimas (incluidas las proteasas y las fosfolipasas liberadas por la rotura) y conserva los orgánulos; isotónico para que los orgánulos ni se hinchen y revienten ni se encojan. 3. Mitocondrias (membrana interna); citosol. 4. $500 + 200 + 300 + 950 = 1950\,\mathrm{mg}$ , el $97.5\,\%$ : pérdidas en las paredes del tubo y en los trasvases. 5. SDH: $15 + 60 + 5 + 4 = 84$ , el $84\,\%$ (parte de la actividad se pierde por daño de las mitocondrias). LDH: $20 + 12 + 8 + 350 = 390$ , el $97.5\,\%$ . 6. $2000/10 = 200\,\mathrm{mg}/\mathrm{g}$ : el $20\,\%$ de la masa fresca (casi todo el resto es agua). 7. $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81 \times 10^{4}/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $92\,\mathrm{s}$ : $20\,\mathrm{min}$ sobran. 8. A $1000\,g$ , $v = 5.4 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; en $600\,\mathrm{s}$ , $3.3\,\mathrm{cm}$ . Repartidas uniformemente en $5\,\mathrm{cm}$ , las mitocondrias situadas a menos de $3.3\,\mathrm{cm}$ del fondo lo alcanzan: el $65\,\%$ , si nada más interviniera. 9. En realidad solo sedimenta el $15\,\%$ : un sedimento real no atrapa todo lo que lo alcanza (los núcleos compactados se resuspenden con cuidado y la capa superior, suelta, se queda en el sobrenadante), y la fórmula sobrestima la velocidad de orgánulos hidratados y no esféricos. Las mitocondrias que están dentro de células enteras o adheridas a los núcleos entran también en el sedimento 1. 10. $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $14\,\mathrm{s}$ . 11. $v = \frac{2}{9}\times(1.2\times 10^{-8})^2\times 600\times 9.81 \times 10^{5}/10^{-3} = 1.9 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $2650\,\mathrm{s}$ , $44\,\mathrm{min}$ . A $10\,000\,g$ la velocidad es $1.9 \times 10^{-6}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ : en $20\,\mathrm{min}$ , $2.3\,\mathrm{mm}$ , de modo que los ribosomas se quedan en el sobrenadante 2. 12. La velocidad va como $r^2$ : a fuerza baja solo se mueven apreciablemente las partículas mayores, de modo que cada etapa sedimenta una clase y deja las menores. Si es demasiado corta, la clase sedimenta de forma incompleta; si es demasiado larga, la clase siguiente empieza a contaminar el sedimento. 13. Homogeneizado $100/2000 = 0.05\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; sedimento 1 $15/500 = 0.03$ ; sedimento 2 $60/200 = 0.30$ ; sedimento 3 $5/300 = 0.017$ ; sobrenadante $4/950 = 0.004$ . 14. Purificación $0.30/0.05 = 6$ ; rendimiento $60/100 = 60\,\%$ . 15. $0.017/0.05 = 0.33$ : el sedimento 3 está empobrecido en mitocondrias; la poca actividad que retiene procede de fragmentos de membrana mitocondrial producidos en la homogeneización, que sedimentan con los microsomas. 16. LDH: homogeneizado $400/2000 = 0.2\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; sobrenadante $350/950 = 0.37\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; purificación $1.8$ ; rendimiento $87.5\,\%$ . 17. El citosol es la mitad de la proteína celular, así que ni siquiera un citosol puro puede más que duplicar la actividad específica; las mitocondrias son la sexta parte o menos, de modo que aislarlas concentra sus enzimas seis veces o más. El rendimiento es alto para la enzima soluble porque no se pierde con los orgánulos dañados. 18. No: el sedimento 2 contiene $200\,\mathrm{mg}$ de proteína y atrapa sobrenadante entre sus partículas; $12\,\mathrm{U}$ es el $3\,\%$ del total, compatible con citosol atrapado. Comprobación: lávese el sedimento (resuspéndase y vuélvase a centrifugar): una enzima atrapada se va, una ligada se queda. 19. Si el sedimento 2 es $60\,\%$ mitocondrias, las mitocondrias puras tienen $0.30/0.6 = 0.5\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; las $100\,\mathrm{U}$ del hígado corresponden entonces a $200\,\mathrm{mg}$ de proteína mitocondrial, el $10\,\%$ de los $2000\,\mathrm{mg}$ . 20. TEM del sedimento fijado, incluido, seccionado finamente y teñido con metales pesados: perfiles arriñonados con doble membrana y crestas, con algunos lisosomas (cuerpos densos) y peroxisomas entre ellos. 21. Obsérvese una gota del sedimento resuspendido al microscopio de contraste de fases y cuéntense las células intactas entre los núcleos libres; si hay muchas, homogenéicese más a fondo (más pasadas, émbolo más ajustado) y vuélvase a centrifugar, ya que los orgánulos atrapados rebajan todos los rendimientos. 22. La centrifugación diferencial separa por tamaño (velocidad $\propto r^2$ ) y los tres orgánulos tienen tamaños parecidos; en un gradiente de densidad una partícula se detiene a su propia densidad independientemente de su tamaño, y las tres densidades son distintas. 23. Los lisosomas intactos mantienen la enzima dentro de una membrana que el sustrato no atraviesa (latencia); el detergente rompe la membrana y la expone. Los lisosomas del sedimento están, por tanto, en su mayoría intactos. 24. El agua es hipotónica: los orgánulos se hinchan y revientan. Las mitocondrias y los lisosomas se rompen, de modo que el sedimento 2 disminuye; la succinato deshidrogenasa (ligada a membrana) pasa en parte al sedimento 3 como fragmentos de membrana; la fosfatasa ácida (soluble dentro del lisosoma) se libera al sobrenadante final. 25. Factor de purificación $6$ , rendimiento $60\,\%$ . El factor lo limita la contaminación (lisosomas, peroxisomas, citosol atrapado: el sedimento 2 es $60\,\%$ mitocondrias); el rendimiento, las mitocondrias perdidas en el sedimento 1 (atrapadas) y rotas durante la homogeneización.

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