Biologia universitária — 1.º ano · Bachelor Year 1

5A célula: unidade da vida

Em 1665 Robert Hooke pôs uma lasca de cortiça sob uma lente e a viu dividida em caixinhas que ele chamou de células, em referência aos aposentos de um mosteiro. Dez anos depois um comerciante de tecidos holandês, Antoni van Leeuwenhoek, polindo as próprias lentes até um aumento que ninguém mais alcançava, viu seres vivos nadando numa gota de água de lagoa, no raspado dos dentes dele, no próprio sêmen. Foi preciso mais um século e meio para enunciar o que os dois tinham visto: que todo organismo é feito de células, e que toda célula vem de uma célula. Este capítulo enuncia a teoria celular e as evidências dela, contrasta os dois tipos de célula, e descreve os instrumentos — os microscópios, a centrífuga, o frasco de cultura — que nos deixam ver as células, desmontá-las e mantê-las vivas fora de um organismo.

5.1 A teoria celular

Definição 5.1 (Célula)

Uma célula é a menor unidade de matéria viva: um volume de citoplasma aquoso delimitado por uma membrana plasmática, contendo o material genético (DNA) e a maquinaria que o expressa, capaz de captar nutrientes, transformar energia, manter a própria organização e, quando as condições permitem, dividir-se em duas células.

Proposição 5.2 (A teoria celular)

Todo organismo é feito de uma ou de várias células, e a célula é a unidade de estrutura e de função dos seres vivos (Schleiden e Schwann, 1838–1839).
Toda célula surge de uma célula preexistente por divisão (Virchow, 1855: omnis cellula e cellula); não há geração espontânea.
O material hereditário é transmitido de célula a célula na divisão, de modo que a continuidade da vida é a continuidade das células.

Evidências. A cortiça de Hooke (1665) e os cortes de plantas de Grew e Malpighi mostraram os tecidos vegetais como conjuntos de câmaras; as lentes de Leeuwenhoek (década de 1670) mostraram organismos unicelulares, células do sangue e espermatozoides. Dois séculos de lentes cada vez melhores encontraram células em todo tecido examinado, animal tanto quanto vegetal, depois que Schwann reconheceu células nucleadas na cartilagem e em embriões. A divisão foi vista diretamente em algas e em embriões, e Virchow não encontrou nenhum tecido, são ou doente, cujas células não viessem de outras células. Os frascos de pescoço de cisne de Pasteur (1861) — caldos que ficavam estéreis por meses quando a poeira não os alcançava, e que fervilhavam em poucos dias quando ela alcançava — encerraram a questão da geração espontânea. O terceiro enunciado é obra do fim do século XIX, que acompanhou os cromossomos pela divisão (Capítulo 18). ∎

À esquerda: o desenho da cortiça feito por Hooke na Micrographia (1665), as primeiras células jamais figuradas — as paredes vazias de células mortas, vistas em duas orientações. À direita: Antoni van Leeuwenhoek, pintado por Jan Verkolje por volta de 1680, cujos microscópios de lente única mostraram pela primeira vez células vivas. — À esquerda: o desenho da cortiça feito por Hooke na *Micrographia* (1665), as primeiras células jamais figuradas — as paredes vazias de células mortas, vistas em duas orientações. À direita: Antoni van Leeuwenhoek, pintado por Jan Verkolje por volta de 1680, cujos microscópios de lente única mostraram pela primeira vez células vivas.

Exemplo 5.3 (Uma célula, muitas células)

Uma bactéria, uma levedura, uma ameba são organismos inteiros de uma só célula, que fazem tudo — alimentar-se, mover-se, dividir-se — em poucos micrômetros. Um ser humano tem cerca de $3 \times 10^{13}$ células de duzentos tipos, nenhuma das quais poderia viver sozinha numa lagoa, e cada uma delas descende por divisões ininterruptas de um único óvulo fecundado. O coelho do Capítulo 2 e o carvalho do Capítulo 3 são a mesma teoria aplicada duas vezes.

5.2 Dois tipos de célula

Definição 5.4 (Células procarióticas e eucarióticas)

Uma célula procariótica (bactérias, arqueias) não tem núcleo: o DNA dela, em geral um único cromossomo circular, fica numa região do citoplasma chamada nucleoide, e ela não tem compartimentos delimitados por membrana. Ela é pequena ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) e delimitada por uma membrana plasmática e, por fora dela, uma parede celular. Uma célula eucariótica (protistas, fungos, plantas, animais) guarda o DNA dela, na forma de vários cromossomos lineares, dentro de um núcleo delimitado por uma membrana dupla, e divide o citoplasma em organelas delimitadas por membrana (Capítulo 6). Ela é maior ( $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) e tem um esqueleto interno de filamentos proteicos.

Uma bactéria (Escherichia coli) aberta. Sem núcleo, sem organelas: um cromossomo circular frouxamente dobrado no citoplasma entre milhares de ribossomos, uma parede por fora da membrana plasmática, flagelos para nadar e pili para aderir. Comprimento de cerca de 2\, µ m. — Uma bactéria (*Escherichia coli*) aberta. Sem núcleo, sem organelas: um cromossomo circular frouxamente dobrado no citoplasma entre milhares de ribossomos, uma parede por fora da membrana plasmática, flagelos para nadar e pili para aderir. Comprimento de cerca de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Escherichia coli ao microscópio eletrônico de varredura (a barra no pé da imagem é de 2\, µ m). Bastonetes de 2\, µ m de comprimento, dos quais mil caberiam num milímetro; uma única célula se divide a cada vinte minutos num meio rico. Imagem: NIAID, domínio público. — *Escherichia coli* ao microscópio eletrônico de varredura (a barra no pé da imagem é de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ). Bastonetes de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de comprimento, dos quais mil caberiam num milímetro; uma única célula se divide a cada vinte minutos num meio rico. Imagem: NIAID, domínio público.

Proposição 5.5 (A célula bacteriana)

A E. coli, a bactéria-modelo, é um bastonete de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de comprimento e $0.8\,\text{µ}\mathrm{m}$ de largura: um volume de cerca de $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ que abriga um cromossomo de $4.6 \times 10^{6}$ pares de bases ( $1.5\,\mathrm{mm}$ de DNA dobrado dez mil vezes), uns $20\,000$ ribossomos, alguns milhões de moléculas de proteína de $2000$ tipos, e muitas vezes um ou mais plasmídeos — pequenas moléculas circulares de DNA que carregam genes adicionais. O envoltório dela é, de dentro para fora, a membrana plasmática, uma parede fina de peptidoglicano (uma malha de cadeias de açúcares ligadas transversalmente por peptídeos curtos, que resiste à pressão interna da célula) e uma membrana externa. As bactérias com uma parede espessa de peptidoglicano e sem membrana externa retêm o cristal violeta da coloração de Gram (gram-positivas); aquelas com parede fina sob uma membrana externa o perdem (gram-negativas, como a E. coli). Os flagelos giram como hélices; os pili prendem a célula a superfícies e a outras células.

Método 5.6 (A coloração de Gram)

Fixe ao calor um esfregaço fino de bactérias sobre uma lâmina.
Core com cristal violeta (todas as células roxas) e depois com iodo, que forma um complexo grande com o corante dentro das células.
Enxágue com álcool: o peptidoglicano espesso das células gram-positivas se contrai e retém o complexo; a parede fina das gram-negativas, uma vez que o álcool dissolveu a membrana externa, deixa que ele seja lavado.
Contraste com um corante rosa (safranina): as células gram-positivas aparecem roxas e as gram-negativas, rosas. O resultado indica a estrutura da parede e, com ela, a sensibilidade a muitos antibióticos.

Os tamanhos das coisas, em escala logarítmica, e os instrumentos que os resolvem. As bactérias ficam logo acima do limite do microscópio óptico; a célula eucariótica é dez vezes maior em cada dimensão, mil vezes em volume.

Exemplo 5.7 (Por que a célula eucariótica é compartimentada)

Uma célula de $20\,\text{µ}\mathrm{m}$ tem mil vezes o volume de uma bactéria, mas apenas cem vezes a superfície de membrana dela (Proposição 1.6). As membranas são onde uma célula carrega as cadeias transdutoras de energia e os sistemas de transporte dela; o eucarioto recupera superfície dobrando membranas dentro de si — a membrana interna de uma mitocôndria, as lâminas do retículo endoplasmático — e ganha, além disso, câmaras separadas em que químicas incompatíveis (a digestão no lisossomo, a síntese no citosol) podem funcionar lado a lado.

5.3 Ver as células: a microscopia

Definição 5.8 (Aumento e resolução)

Um microscópio amplia (aumenta a imagem) e resolve (separa pontos vizinhos). Só o segundo limita o que se pode ver: o poder de resolução é a menor distância $d$ entre dois pontos que ainda aparecem distintos,

d = \frac{0.61\,\lambda}{\mathrm{NA}},

em que $\lambda$ é o comprimento de onda da iluminação e $\mathrm{NA}$ a abertura numérica da objetiva (o seno do semiângulo de coleta de luz dela vezes o índice de refração do meio, no máximo cerca de $1.4$ com óleo). Ampliar além do poder de resolução aumenta o borrão, e não o detalhe.

Proposição 5.9 (Microscópios óptico e eletrônico)

Com luz visível ( $\lambda \approx 550\,\mathrm{nm}$ ) e $\mathrm{NA} = 1.4$ , o microscópio óptico resolve $0.24\,\text{µ}\mathrm{m}$ : células, núcleos, cloroplastos, mitocôndrias como pontos, bactérias como bastonetes — e espécimes vivos e em movimento. O contraste numa célula transparente é obtido por coloração (que em geral mata), por contraste de fase (que converte diferenças de índice de refração em diferenças de brilho) ou por fluorescência (marcar uma molécula com um corante ou uma proteína fluorescente e captar apenas a luz dela). O microscópio eletrônico usa elétrons de comprimento de onda de alguns picômetros; a resolução prática dele, limitada pelas lentes, é de cerca de $0.2\,\mathrm{nm}$ na transmissão (MET: os elétrons atravessam um corte de $50\,\mathrm{nm}$ de espessura corado com metais pesados, o que dá a estrutura interna das organelas) e de alguns nanômetros na varredura (MEV: um feixe varre uma superfície recoberta de metal, o que dá o relevo dela em profundidade). A microscopia eletrônica exige vácuo e espécimes mortos, fixados e desidratados.

O microscópio óptico composto: a objetiva forma uma imagem intermediária ampliada e invertida, que a ocular amplia de novo para o olho. É a abertura numérica da objetiva, e não o aumento total, que determina o que pode ser resolvido.

Um microscópio óptico composto: lâmpada e condensador abaixo da platina, um revólver de objetivas acima dela, oculares binoculares. Resolução de 0.2\, µ m, aumento de até 1000\,, espécimes vivos possíveis. — Um microscópio óptico composto: lâmpada e condensador abaixo da platina, um revólver de objetivas acima dela, oculares binoculares. Resolução de $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ , aumento de até $1000\,$ , espécimes vivos possíveis.

Método 5.10 (Escolher o instrumento)

Para acompanhar um processo vivo (divisão celular, movimento, uma proteína fluorescente que passa de um compartimento a outro): microscopia óptica, com contraste de fase ou fluorescência, em células não fixadas.
Para contar e identificar células num tecido: uma preparação fixada, cortada e corada, ao microscópio óptico.
Para ver a estrutura interna de uma organela, de uma membrana, de um vírus: microscopia eletrônica de transmissão de cortes finos, ou de partículas com coloração negativa.
Para ver o relevo da superfície de uma célula ou de um tecido: microscopia eletrônica de varredura.
Para localizar uma proteína: imunofluorescência (óptica) ou marcação com imunogold (eletrônica), com um anticorpo contra ela.

Exemplo 5.11 (Uma bactéria e uma mitocôndria)

Ao microscópio óptico com $1000\times$ , uma célula de E. coli é um bastonete de $2\,\mathrm{mm}$ na escala da retina, sem interior visível; uma mitocôndria é um ponto no limite da resolução. Num corte de MET a mesma bactéria mostra as duas membranas, a parede, o nucleoide como uma região fibrosa e pálida e os ribossomos como grânulos escuros; a mitocôndria mostra a membrana dupla e as dobras da membrana interna. Nenhuma das duas está viva.

5.4 Desmontar as células e mantê-las vivas

Definição 5.12 (Fracionamento celular)

O fracionamento celular separa os componentes de uma célula para estudo. O tecido é homogeneizado — as células são rompidas num tampão frio e isotônico, por trituração ou cisalhamento, deixando as organelas intactas — e o homogeneizado é submetido à centrifugação diferencial: uma série de centrifugações de força e duração crescentes, cada uma das quais sedimenta as partículas maiores e mais densas que ainda restam em suspensão. Cada fração é identificada pela aparência ao microscópio eletrônico e pelas enzimas marcadoras, atividades que se sabe residirem em um único compartimento.

Centrifugação diferencial de um homogeneizado. Cada centrifugação sedimenta o que é maior ou mais denso do que aquilo que a anterior deixou em suspensão: primeiro os núcleos, depois as mitocôndrias, depois os fragmentos de membrana, e por fim o citosol solúvel. As enzimas marcadoras dizem para onde foi cada organela.

Frações depois de centrifugações sucessivas: os sedimentos de núcleos, de mitocôndrias e de microssomos, cada um sob o sobrenadante esclarecido dele.

Proposição 5.13 (Sedimentação)

Uma partícula esférica de raio $r$ e densidade $\rho_p$ num fluido de densidade $\rho_f$ e viscosidade $\eta$ , num campo centrífugo $g_c$ (um múltiplo de $g$ ), sedimenta à velocidade estacionária

v = \frac{2}{9}\,\frac{r^2\,(\rho_p - \rho_f)\,g_c}{\eta}

(lei de Stokes). A velocidade cresce com o quadrado do raio: um núcleo de $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ cai cem vezes mais rápido que uma mitocôndria de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , que cai mil vezes mais rápido que um ribossomo de $15\,\mathrm{nm}$ . É por isso que o mesmo tubo os separa a velocidades crescentes.

Demonstração. Na velocidade estacionária o arrasto de Stokes, $6\pi\eta r v$ , equilibra o peso aparente da partícula no fluido, $\frac{4}{3}\pi r^3(\rho_p - \rho_f)g_c$ ; resolver para $v$ dá a fórmula. ∎

Definição 5.14 (Cultura de células)

A cultura de células mantém as células vivas e em divisão fora do organismo, num meio estéril que fornece nutrientes, sais, fatores de crescimento e, para as células animais, uma superfície de adesão, à temperatura do organismo. Bactérias e leveduras crescem em meios simples e duplicam em minutos a horas; as células animais retiradas de um tecido (as culturas primárias) se dividem um número limitado de vezes, ao passo que as linhagens celulares derivadas de tumores ou de células transformadas se dividem indefinidamente. A cultura faz da célula um objeto experimental: um tipo, um meio, uma variável de cada vez.

Exemplo 5.15 (Uma curva de crescimento)

Um frasco de E. coli num meio rico a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : uma fase de latência de meia hora, depois crescimento exponencial — a contagem dobra a cada $20\,\mathrm{min}$ , de modo que $N = N_0\,2^{t/20}$ — até que um nutriente se esgote ou os resíduos se acumulem e a cultura atinja um patamar perto de $10^9$ células por mililitro. A partir de uma única célula, $2^{30} \approx 10^9$ células em dez horas. A mesma curva, com um tempo de duplicação de um dia, descreve uma cultura de células humanas.

5.5 Exercícios

Exercício 5.1 ★

Enuncie as três proposições da teoria celular e cite uma evidência para cada uma.

Solução

Solução de Exercício 5.1.

Todos os organismos são feitos de células (todo tecido examinado ao microscópio, vegetal e animal, as mostra); toda célula vem de uma célula (divisão observada em embriões e algas; os frascos de Pasteur excluem a geração espontânea); o material hereditário passa na divisão (cromossomos acompanhados ao longo da mitose).

Exercício 5.2 ★

Liste quatro diferenças entre uma célula procariótica e uma eucariótica.

Solução

Solução de Exercício 5.2.

Núcleo (ausente / presente), organelas delimitadas por membrana (ausentes / presentes), cromossomo (um circular / vários lineares), tamanho ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ / $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ), parede celular de peptidoglicano (bactérias) / de celulose, de quitina ou nenhuma, citoesqueleto (rudimentar / elaborado).

Exercício 5.3 ★

A partir da figura das escalas de tamanho, quantas bactérias enfileiradas cobrem um ovo de rã? E quantas células animais?

Solução

Solução de Exercício 5.3.

$1\,\mathrm{mm}/1\,\text{µ}\mathrm{m} = 1000$ bactérias; $1000/20 = 50$ células animais.

Exercício 5.4 ★

Por que um microscópio óptico de $2000\times$ não mostra mais detalhe que um de $1000\times$ ?

Solução

Solução de Exercício 5.4.

A resolução depende do comprimento de onda e da abertura numérica, e não do aumento; além de cerca de $1000\times$ a imagem só amplia o borrão do limite de difração ( $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ), sem separar nada de novo.

Exercício 5.5 ★★

Calcule o poder de resolução de uma objetiva de $\mathrm{NA} = 0.65$ em luz verde ( $550\,\mathrm{nm}$ ) e em luz azul ( $450\,\mathrm{nm}$ ). Ela consegue resolver duas bactérias separadas por $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ? E dois ribossomos separados por $30\,\mathrm{nm}$ ?

Solução

Solução de Exercício 5.5.

$0.61\times 550/0.65 = 516\,\mathrm{nm}$ ; em azul, $422\,\mathrm{nm}$ . Duas bactérias separadas por $500\,\mathrm{nm}$ : por pouco, em luz azul; ribossomos separados por $30\,\mathrm{nm}$ : não, por um fator de quinze.

Exercício 5.6 ★★

Uma coloração de Gram de uma cultura mista mostra cocos roxos e bastonetes rosas. O que cada cor diz sobre a parede celular? Qual dos dois é a E. coli?

Solução

Solução de Exercício 5.6.

Roxo: parede espessa de peptidoglicano que retém o complexo cristal violeta–iodo, sem membrana externa (gram-positiva). Rosa: peptidoglicano fino sob uma membrana externa, corante lavado, contraste posterior (gram-negativa). A E. coli é um bastonete gram-negativo: os bastonetes rosas.

Exercício 5.7 ★★

Usando a lei de Stokes com $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ e $\rho_p - \rho_f = 100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ , calcule a velocidade de sedimentação de uma mitocôndria ( $r = 0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) a $10\,000\,g$ e o tempo para percorrer $5\,\mathrm{cm}$ . Repita para um núcleo ( $r = 4\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) a $1000\,g$ .

Solução

Solução de Exercício 5.7.

Mitocôndria: $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81\times 10^4/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ em $92\,\mathrm{s}$ . Núcleo a $1000\,g$ : $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ em $14\,\mathrm{s}$ .

Exercício 5.8 ★★

As atividades marcadoras de um homogeneizado são: succinato-desidrogenase $80\,\%$ no sedimento 2, $15\,\%$ no sedimento 1, $5\,\%$ no sobrenadante; lactato-desidrogenase $95\,\%$ no sobrenadante final. Interprete cada número, inclusive os $15\,\%$ do sedimento 1.

Solução

Solução de Exercício 5.8.

A succinato-desidrogenase é mitocondrial: $80\,\%$ das mitocôndrias estão no sedimento 2; os $15\,\%$ do sedimento 1 são mitocôndrias aprisionadas em células intactas e restos, ou arrastadas junto com os núcleos; os $5\,\%$ do sobrenadante vêm de mitocôndrias rompidas durante a homogeneização. A lactato-desidrogenase é citosólica e solúvel: ela fica no sobrenadante final.

Exercício 5.9 ★★

Que microscópio você usaria para (a) observar um glóbulo branco englobar uma bactéria, (b) contar as mitocôndrias num corte de músculo, (c) ver os poros de um envoltório nuclear, (d) ver a forma da superfície de um grão de pólen? Justifique cada escolha.

Solução

Solução de Exercício 5.9.

(a) Microscopia óptica de contraste de fase em células vivas (o processo leva minutos e exige células vivas). (b) Microscopia óptica de um corte corado, ou MET para ter certeza (as mitocôndrias estão no limite da óptica). (c) MET (os poros têm $100\,\mathrm{nm}$ ). (d) MEV (relevo da superfície).

Exercício 5.10 ★★★

Os frascos de Pasteur: um caldo fervido num frasco de pescoço de cisne fica límpido indefinidamente; inclinado de modo que o caldo toque a poeira do pescoço, ele fica turvo em dois dias. Explique o que cada observação exclui e o que o par prova, e diga por que ferver num frasco lacrado não tinha, sozinho, encerrado a questão.

Solução

Solução de Exercício 5.10.

O frasco límpido exclui que o próprio ar, ou o próprio caldo fervido, gere vida: o ar entra livremente pelo pescoço aberto. O frasco turvo, depois do contato com a poeira, mostra que o que o pescoço havia retido — partículas do ar — é a fonte dos organismos. Juntos eles provam que os micróbios vêm de micróbios carregados pela poeira. Um frasco fervido e lacrado deixava em aberto a objeção de que o lacre havia excluído o ar de que uma “força vital” precisaria; o pescoço de cisne admite o ar e exclui apenas a poeira.

Exercício 5.11 ★★★

Uma cultura de E. coli começa com $10^3$ células por mililitro e dobra a cada $25\,\mathrm{min}$ . Quando ela chega a $10^8$ por mililitro? Se cada célula tem massa de $1\,\mathrm{pg}$ , qual é a massa bacteriana num litro nesse ponto, e por que o crescimento para pouco depois mesmo com glicose em excesso?

Solução

Solução de Exercício 5.11.

$10^5 = 2^{n}$ dá $n = 16.6$ duplicações, ou seja, $415\,\mathrm{min}$ , cerca de $7\,\mathrm{h}$ . $10^8\times 10^3\,\mathrm{mL}\times1\,\mathrm{pg} = 0.1\,\mathrm{g}$ por litro. O crescimento para porque o oxigênio (que o meio só consegue fornecer a alguns miligramas por litro), um mineral, ou o acúmulo de ácidos e resíduos se torna limitante, e não a glicose.

Exercício 5.12 ★★★

“A célula eucariótica é uma bactéria que aprendeu a dobrar.” Discuta em um parágrafo, usando a razão superfície/volume, as membranas das organelas e o que os compartimentos permitem.

Solução

Solução de Exercício 5.12.

Uma célula dez vezes maior em cada dimensão tem um décimo da superfície de membrana por unidade de volume; como as membranas carregam a maquinaria transdutora de energia e de transporte, a célula grande passaria fome. O eucarioto multiplica a membrana dobrando-a dentro de si (retículo endoplasmático, membrana mitocondrial interna, tilacoides) e, com isso, cria também compartimentos fechados em que processos incompatíveis — digestão ácida, química oxidativa, guarda do DNA — funcionam separadamente, cada um nas próprias condições. A imagem é adequada no que toca às membranas, e incompleta: o eucarioto também ganhou um citoesqueleto e um núcleo, e as mitocôndrias dele são descendentes de bactérias englobadas, e não dobras.

5.6 Problema: Fracionar um fígado

Problema 5.1

Problema de fim de semana — dez gramas de fígado de rato desmontados por centrifugação: sedimentos, marcadores, lei de Stokes e o balanço de uma enzima, terminando no fator de purificação da fração mitocondrial

$10\,\mathrm{g}$ de fígado de rato são homogeneizados em $50\,\mathrm{mL}$ de sacarose isotônica fria e centrifugados em três etapas: $1000\,g$ por $10\,\mathrm{min}$ (sedimento 1), $10\,000\,g$ por $20\,\mathrm{min}$ (sedimento 2), $100\,000\,g$ por $60\,\mathrm{min}$ (sedimento 3), restando o sobrenadante final. O teor de proteína e duas atividades enzimáticas são medidos no homogeneizado e em cada fração:

fração	proteína (mg)	succinato-desidrogenase (U)	lactato-desidrogenase (U)
homogeneizado	2000	100	400
sedimento 1	500	15	20
sedimento 2	200	60	12
sedimento 3	300	5	8
sobrenadante final	950	4	350

Tome $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ para o meio, um percurso de sedimentação de $5\,\mathrm{cm}$ e $g = 9.81\,\mathrm{m}/\mathrm{s}^{2}$ .

Parte I — O que está onde.

Cite a organela principal de cada sedimento.
Por que o meio de homogeneização precisa ser frio e isotônico?
A succinato-desidrogenase é marcadora de qual compartimento? E a lactato-desidrogenase?
Calcule a recuperação de proteína: a soma sobre as frações como porcentagem do homogeneizado. Comente.
Calcule da mesma maneira a recuperação de cada atividade enzimática.
Calcule o teor de proteína por grama de fígado e a fração da massa fresca do fígado que é proteína.

Parte II — Lei de Stokes. Mitocôndrias: raio $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , excesso de densidade $100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ . Núcleos: raio $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ , mesmo excesso. Ribossomos: raio $12\,\mathrm{nm}$ , excesso de densidade $600\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ .

Calcule a velocidade de sedimentação de uma mitocôndria a $10\,000\,g$ e o tempo para percorrer $5\,\mathrm{cm}$ . $20\,\mathrm{min}$ bastam?
Calcule a distância que uma mitocôndria percorre durante a primeira centrifugação ( $1000\,g$ , $10\,\mathrm{min}$ ). Que fração das mitocôndrias, uniformemente distribuídas no início, seria sedimentada na primeira etapa?
Compare com os $15\,\%$ de succinato-desidrogenase encontrados no sedimento 1. O que mais pode arrastar mitocôndrias para o sedimento 1?
Calcule o tempo para um núcleo percorrer $5\,\mathrm{cm}$ a $1000\,g$ .
Calcule o tempo para um ribossomo percorrer $5\,\mathrm{cm}$ a $100\,000\,g$ . Um ribossomo seria sedimentado a $10\,000\,g$ em $20\,\mathrm{min}$ ?
Explique por que a sequência de centrifugações é de força crescente e por que cada etapa precisa ser longa o bastante, mas não longa demais.

Parte III — Atividade específica e purificação. A atividade específica de uma enzima numa fração é a atividade dela por miligrama de proteína. O fator de purificação de uma fração para uma enzima é a atividade específica dela dividida pela do homogeneizado; o rendimento é a atividade da fração dividida pela do homogeneizado.

Calcule a atividade específica da succinato-desidrogenase no homogeneizado e em cada fração.
Calcule o fator de purificação e o rendimento da succinato-desidrogenase no sedimento 2.
Calcule o fator de purificação da succinato-desidrogenase no sedimento 3 e interprete o valor dele.
Calcule a atividade específica da lactato-desidrogenase no homogeneizado e no sobrenadante final, e o fator de purificação e o rendimento correspondentes.
Por que o fator de purificação da enzima citosólica é menor que o da enzima mitocondrial, embora o rendimento dela seja maior?
O sedimento 2 contém $12\,\mathrm{U}$ de lactato-desidrogenase. A enzima é em parte mitocondrial? Proponha uma explicação melhor e uma maneira de testá-la.
Que fração da proteína do fígado é mitocondrial, se toda a succinato-desidrogenase for mitocondrial e o sedimento 2 tiver $60\,\%$ de pureza? (Dica: use a atividade específica das mitocôndrias puras, deduzida do sedimento 2, e a atividade total.)

Parte IV — Conferir as frações.

O sedimento 2 é examinado por microscopia eletrônica: qual instrumento e qual preparação, e o que deve ser visto?
Como você verificaria se há células intactas no sedimento 1, e o que faria se encontrasse muitas?
O sedimento 2 é ressuspenso e depositado sobre um gradiente de densidade de sacarose, e depois centrifugado até que cada partícula pare onde a densidade dela iguala a do meio. As mitocôndrias formam banda a $1.18\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , os lisossomos a $1.22\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ e os peroxissomos a $1.24\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . Explique por que essa separação funciona quando a centrifugação diferencial não conseguia obtê-la.
A atividade da fosfatase ácida no sedimento 2 sobe bruscamente quando um detergente é acrescentado ao ensaio. Explique, e diga o que isso informa sobre o estado dos lisossomos no sedimento.
Um estudante homogeneíza em água pura em vez de sacarose isotônica. Preveja o efeito sobre o sedimento 2 e sobre a distribuição da succinato-desidrogenase e da fosfatase ácida.
Resuma o resultado: o fator de purificação e o rendimento da fração mitocondrial, e o que limita cada um.

Solução

Solução de Problema 5.1.

1. Sedimento 1: núcleos (e células intactas, restos). Sedimento 2: mitocôndrias (com lisossomos e peroxissomos). Sedimento 3: microssomos (fragmentos de retículo endoplasmático) e ribossomos. 2. O frio retarda as enzimas (inclusive as proteases e fosfolipases liberadas pelo rompimento) e preserva as organelas; o meio é isotônico para que as organelas não inchem e estourem nem murchem. 3. Mitocôndrias (membrana interna); citosol. 4. $500 + 200 + 300 + 950 = 1950\,\mathrm{mg}$ , $97.5\,\%$ : perdas nas paredes dos tubos e nas transferências. 5. SDH: $15 + 60 + 5 + 4 = 84$ , $84\,\%$ (parte da atividade perdida por danos às mitocôndrias). LDH: $20 + 12 + 8 + 350 = 390$ , $97.5\,\%$ . 6. $2000/10 = 200\,\mathrm{mg}/\mathrm{g}$ : $20\,\%$ da massa fresca (quase todo o resto é água). 7. $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81 \times 10^{4}/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ em $92\,\mathrm{s}$ : $20\,\mathrm{min}$ é de sobra. 8. A $1000\,g$ , $v = 5.4 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; em $600\,\mathrm{s}$ , $3.3\,\mathrm{cm}$ . Uniformemente distribuídas ao longo de $5\,\mathrm{cm}$ , as mitocôndrias a menos de $3.3\,\mathrm{cm}$ do fundo o alcançam: $65\,\%$ , se nada mais interviesse. 9. Só $15\,\%$ de fato sedimentam: um sedimento real não retém tudo o que o alcança (os núcleos compactados são ressuspensos com cuidado e a camada superior, frouxa, permanece no sobrenadante), e a fórmula superestima a velocidade de organelas não esféricas e hidratadas. Mitocôndrias dentro de células intactas e aderidas aos núcleos também entram no sedimento 1. 10. $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $14\,\mathrm{s}$ . 11. $v = \frac{2}{9}\times(1.2\times 10^{-8})^2\times 600\times 9.81 \times 10^{5}/10^{-3} = 1.9 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ em $2650\,\mathrm{s}$ , $44\,\mathrm{min}$ . A $10\,000\,g$ a velocidade é $1.9 \times 10^{-6}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ : em $20\,\mathrm{min}$ , $2.3\,\mathrm{mm}$ , de modo que os ribossomos ficam no sobrenadante 2. 12. A velocidade varia com $r^2$ : em força baixa só as partículas maiores se movem de modo apreciável, de modo que cada etapa sedimenta uma classe e deixa as menores. Curta demais, a classe é sedimentada de forma incompleta; longa demais, a classe seguinte começa a contaminar o sedimento. 13. Homogeneizado $100/2000 = 0.05\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; sedimento 1 $15/500 = 0.03$ ; sedimento 2 $60/200 = 0.30$ ; sedimento 3 $5/300 = 0.017$ ; sobrenadante $4/950 = 0.004$ . 14. Purificação $0.30/0.05 = 6$ ; rendimento $60/100 = 60\,\%$ . 15. $0.017/0.05 = 0.33$ : o sedimento 3 é empobrecido em mitocôndrias; a pouca atividade que ele retém vem de fragmentos de membrana mitocondrial produzidos pela homogeneização, que sedimentam com os microssomos. 16. LDH: homogeneizado $400/2000 = 0.2\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; sobrenadante $350/950 = 0.37\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; purificação $1.8$ ; rendimento $87.5\,\%$ . 17. O citosol é metade da proteína da célula, de modo que mesmo um citosol puro só pode dobrar a atividade específica; as mitocôndrias são um sexto ou menos, de modo que isolá-las concentra as enzimas delas seis vezes ou mais. O rendimento é alto para a enzima solúvel porque ela não se perde junto com as organelas danificadas. 18. Não: o sedimento 2 retém $200\,\mathrm{mg}$ de proteína e aprisiona sobrenadante entre as partículas dele; $12\,\mathrm{U}$ são $3\,\%$ do total, compatível com citosol aprisionado. Teste: lave o sedimento (ressuspenda e centrifugue de novo): uma enzima aprisionada sai, uma enzima ligada fica. 19. Se o sedimento 2 tem $60\,\%$ de mitocôndrias, as mitocôndrias puras têm $0.30/0.6 = 0.5\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; as $100\,\mathrm{U}$ do fígado correspondem então a $200\,\mathrm{mg}$ de proteína mitocondrial, $10\,\%$ dos $2000\,\mathrm{mg}$ . 20. MET de um sedimento fixado, incluído, cortado em cortes finos e corado com metais pesados: perfis em forma de feijão com membrana dupla e cristas, com alguns lisossomos (corpos densos) e peroxissomos entre eles. 21. Observe uma gota do sedimento ressuspenso ao microscópio de contraste de fase e conte as células intactas entre os núcleos livres; se houver muitas, homogeneíze de forma mais completa (mais golpes, pistilo mais justo) e centrifugue de novo, já que organelas aprisionadas baixam todos os rendimentos. 22. A centrifugação diferencial separa por tamanho (velocidade $\propto r^2$ ) e as três organelas têm tamanhos parecidos; num gradiente de densidade uma partícula para na própria densidade, seja qual for o tamanho dela, e as três densidades diferem. 23. Lisossomos intactos mantêm a enzima dentro de uma membrana que o substrato não atravessa (latência); o detergente rompe a membrana e a expõe. Os lisossomos do sedimento estão, portanto, quase todos intactos. 24. A água é hipotônica: as organelas incham e estouram. Mitocôndrias e lisossomos se rompem, de modo que o sedimento 2 encolhe; a succinato-desidrogenase (ligada à membrana) vai em parte para o sedimento 3 como fragmentos de membrana; a fosfatase ácida (solúvel dentro do lisossomo) é liberada no sobrenadante final. 25. Fator de purificação $6$ , rendimento $60\,\%$ . O fator é limitado pela contaminação (lisossomos, peroxissomos, citosol aprisionado: o sedimento 2 tem $60\,\%$ de mitocôndrias); o rendimento, pelas mitocôndrias perdidas para o sedimento 1 (aprisionadas) e rompidas durante a homogeneização.

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