Biologia universitária — 1.º ano · Bachelor Year 1

13Enzimas e catálise bioquímica

Despeje água oxigenada sobre uma batata cortada e ela espuma: uma única molécula de catalase nas células da batata parte quarenta milhões de moléculas de peróxido por segundo, uma reação que, deixada por conta própria, levaria anos. O peróxido ia se decompor de todo jeito — a reação é morro abaixo —, mas não num tempo útil. Toda reação da célula é assim: a termodinâmica diz para que lado ela pode ir, e uma enzima diz se ela vai agora. Este capítulo descreve o que uma enzima faz a uma reação, a cinética pela qual as enzimas são medidas e comparadas, as maneiras de inibi-las, e as maneiras pelas quais a célula as liga e desliga.

13.1 Catálise

Definição 13.1 (Enzima, substrato, sítio ativo)

Uma enzima é uma proteína (raramente um RNA) que catalisa uma reação: ela aumenta a velocidade sem ser consumida e sem mudar o equilíbrio. As moléculas sobre as quais ela age são os substratos dela; eles se ligam no sítio ativo, uma fenda revestida por alguns resíduos, onde acontece a química. As enzimas são específicas — para um substrato ou uma família, para uma ligação, para um estereoisômero — e são nomeadas pelo substrato e pela reação delas com o sufixo -ase (lactase, DNA-polimerase, succinato-desidrogenase), em seis classes: oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Muitas precisam de um cofator não proteico: um íon metálico (Zn, Mg, Fe) ou uma coenzima orgânica — $\mathrm{NAD^+}$ , FAD, coenzima A, quase todas feitas a partir de vitaminas, que é para isso que as vitaminas servem.

Proposição 13.2 (O que uma enzima muda e o que ela não muda)

Uma reação passa por um estado de transição, um arranjo tensionado dos átomos de energia livre maior que a dos reagentes ou a dos produtos pela energia de ativação $E_a$ ; só as moléculas que a agitação térmica leva por cima dessa barreira reagem, numa fração proporcional a $e^{-E_a/RT}$ . Uma enzima liga o estado de transição com mais força que o substrato — o sítio ativo dela é complementar à forma tensionada — e assim baixa o $E_a$ : baixá-lo em $34\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ (o valor de umas poucas ligações de hidrogênio) a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplica a velocidade por $e^{34\,000/2580} \approx 10^6$ . Ela não muda o $\Delta G$ nem a constante de equilíbrio, que dependem apenas dos reagentes e dos produtos: uma enzima acelera igualmente a reação direta e a inversa e leva o sistema ao mesmo equilíbrio mais depressa.

A energia livre ao longo de uma reação. A enzima (vermelho) baixa a barreira do estado de transição e deixa intocada a diferença entre substrato e produto — e portanto o equilíbrio.

Água oxigenada sobre uma batata cortada: a catalase das células a parte em água e oxigênio quarenta milhões de vezes por segundo por molécula de enzima, e o oxigênio sai espumando.

Proposição 13.3 (Como o sítio ativo funciona)

Um sítio ativo acelera a reação dele por vários meios ao mesmo tempo: ele liga e orienta os substratos, de modo que os grupos reagentes se encontrem na geometria certa, substituindo uma colisão rara por uma certa; ele tensiona o substrato em direção ao estado de transição (encaixe induzido: a enzima se fecha em torno do substrato, e o encaixe é melhor para o estado de transição); as cadeias laterais dele agem como ácidos e bases, entregando e recebendo prótons do substrato no momento certo (a histidina, com o p $K_a$ dela perto de 7, faz isso em muitas enzimas); algumas formam uma ligação covalente transitória com o substrato (as serina proteases); e os íons metálicos dele polarizam ligações e estabilizam cargas. A água é em grande parte excluída do sítio, para que as cargas e as ligações de hidrogênio ajam com toda a força.

Exemplo 13.4 (Três enzimas)

A lisozima, presente nas lágrimas e na clara do ovo, tensiona um anel de açúcar da parede bacteriana até a forma do estado de transição e corta a cadeia: aceleração de $10^8$ vezes. A anidrase carbônica, nas hemácias, segura um íon zinco que transforma a água num hidróxido pronto para atacar o $\mathrm{CO_2}$ : um milhão de moléculas por segundo, a enzima mais rápida depois da catalase. A quimotripsina, no suco pancreático, usa uma serina tornada reativa por uma histidina para cortar proteínas depois de resíduos aromáticos: cem por segundo, com um intermediário covalente.

13.2 Cinética enzimática

Definição 13.5 (Velocidade inicial, saturação)

A velocidade $v$ de uma reação enzimática é a quantidade de produto formada por unidade de tempo ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , ou unidades de enzima: $1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). Ela é medida como velocidade inicial $v_0$ , antes que o substrato se esgote ou que o produto se acumule. Numa concentração fixa de enzima, $v_0$ sobe com a concentração de substrato $[S]$ e depois satura num máximo $V_{\max}$ : a enzima está plenamente ocupada e não pode ir mais rápido.

Teorema 13.6 (Michaelis–Menten)

Para uma enzima $E$ que liga o substrato dela de modo reversível e o converte,

E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_{\text{cat}}}{\longrightarrow} E + P ,

a velocidade inicial na concentração de substrato $[S]$ é

v_0 = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_m + [S]}, \qquad V_{\max} = k_{\text{cat}}\,[E]_{\text{tot}}, \qquad K_m = \frac{k_{-1} + k_{\text{cat}}}{k_1} .

O $K_m$ , a constante de Michaelis, é a concentração de substrato em que a velocidade é metade da máxima, e mede quanto substrato a enzima precisa; o $k_{\text{cat}}$ , o número de renovação, é o número de moléculas de substrato que uma enzima converte por segundo quando saturada; a razão $k_{\text{cat}}/K_m$ é a eficiência catalítica, a constante de velocidade em substrato baixo, limitada superiormente pela velocidade com que o substrato consegue alcançar a enzima por difusão, cerca de $10^8$ – $10^9$ $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ .

Demonstração. Suponha um estado estacionário em que $ES$ é formado tão depressa quanto desaparece (válido depois dos primeiros milissegundos, enquanto $[S] \gg [E]$ ): $k_1[E][S] = (k_{-1} + k_{\text{cat}})[ES]$ , de modo que $[E][S] = K_m[ES]$ com o $K_m$ definido acima. A conservação dá $[E] = [E]_{\text{tot}} - [ES]$ ; substituindo, $([E]_{\text{tot}} - [ES])[S] = K_m[ES]$ , e daí $[ES] = [E]_{\text{tot}}[S]/(K_m + [S])$ . A velocidade é $v_0 = k_{\text{cat}}[ES]$ , o que dá a fórmula; com $[S] \gg K_m$ , $v_0 \to k_{\text{cat}}[E]_{\text{tot}} = V_{\max}$ , e com $[S] = K_m$ , $v_0 = V_{\max}/2$ . ∎

À esquerda: a hipérbole de Michaelis–Menten para K_m = 2\, mmol/ L e V_ = 1\, µ mol/ min, com os seis pontos medidos do problema de fim de semana. À direita: os mesmos dados num gráfico de Lineweaver–Burk, 1/v_0 contra 1/[S]: uma reta cujas interseções dão V_ e K_m. — À esquerda: a hipérbole de Michaelis–Menten para $K_m = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ e $V_{\max} = 1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , com os seis pontos medidos do problema de fim de semana. À direita: os mesmos dados num gráfico de Lineweaver–Burk, $1/v_0$ contra $1/[S]$ : uma reta cujas interseções dão $V_{\max}$ e $K_m$ .

Método 13.7 (Medir $K_m$ e $V_{\max}$ )

Prepare uma série de concentrações de substrato que cubra de $K_m/4$ a $10K_m$ , com a mesma concentração de enzima; acompanhe o produto (cor, absorbância, gás) durante o primeiro minuto e tome a inclinação como $v_0$ .
Represente $v_0$ contra $[S]$ : a hipérbole dá um $V_{\max}$ aproximado (o patamar) e o $K_m$ (a concentração na metade dele).
Para precisão, inverta: $1/v_0 = (K_m/V_{\max})(1/[S]) + 1/V_{\max}$ (Lineweaver–Burk). A interseção da reta com o eixo $y$ é $1/V_{\max}$ , com o eixo $x$ é $-1/K_m$ , e a inclinação dela é $K_m/V_{\max}$ .
Divida $V_{\max}$ pela concentração de enzima para obter $k_{\text{cat}}$ ; divida por $K_m$ para a eficiência. Repita com um inibidor para ver qual parâmetro ele muda.

Um ensaio enzimático: o produto absorve luz, e o espectrofotômetro registra o aparecimento dele segundo a segundo; a inclinação inicial é v_0. — Um ensaio enzimático: o produto absorve luz, e o espectrofotômetro registra o aparecimento dele segundo a segundo; a inclinação inicial é $v_0$ .

Exemplo 13.8 (Enzimas comparadas)

enzima	$K_m$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ )	$k_{\text{cat}}$ ( $\mathrm{s}^{-1}$ )	$k_{\text{cat}}/K_m$ ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ )
catalase	$2.5 \times 10^{-2}$	$4 \times 10^{7}$	$1.6 \times 10^{9}$
anidrase carbônica	$1.2 \times 10^{-2}$	$1 \times 10^{6}$	$8 \times 10^{7}$
quimotripsina	$1.5 \times 10^{-2}$	100	$7 \times 10^{3}$
lisozima	$6 \times 10^{-6}$	0.5	$8 \times 10^{4}$
DNA-polimerase	$1 \times 10^{-5}$	15	$1.5 \times 10^{6}$

A catalase e a anidrase carbônica trabalham no limite da difusão: toda colisão com o substrato é produtiva. A quimotripsina é lenta, mas precisa ser — ela corta uma ligação peptídica, tarefa bem mais difícil que partir peróxido.

13.3 Inibição

Definição 13.9 (Inibidores)

Um inibidor baixa a velocidade de uma enzima. Os inibidores irreversíveis se ligam covalentemente e destroem de vez a atividade da enzima (os agentes neurotóxicos sobre a acetilcolinesterase, a penicilina sobre a enzima que faz as ligações cruzadas da parede bacteriana, a aspirina sobre a enzima que fabrica as prostaglandinas). Os inibidores reversíveis se ligam por ligações fracas e podem ser lavados; conforme o lugar em que se ligam:

competitivo: o inibidor se parece com o substrato e ocupa o sítio ativo; ele eleva o $K_m$ aparente (pelo fator $1 + [I]/K_i$ ) e deixa o $V_{\max}$ inalterado — substrato suficiente o desloca;
não competitivo: o inibidor se liga em outro lugar e estraga a catálise, haja ou não substrato ligado; ele baixa o $V_{\max}$ e deixa o $K_m$ inalterado — nenhuma quantidade de substrato o vence;
incompetitivo: o inibidor só se liga ao complexo $ES$ ; o $V_{\max}$ e o $K_m$ caem os dois.

O $K_i$ , a constante de dissociação do inibidor, mede a potência dele: quanto menor, mais forte.

Gráficos de Lineweaver–Burk com os dois inibidores comuns. Um inibidor competitivo gira a reta em torno da interseção com y (V_ inalterado, K_m elevado); um não competitivo a gira em torno da interseção com x (K_m inalterado, V_ reduzido). — Gráficos de Lineweaver–Burk com os dois inibidores comuns. Um inibidor competitivo gira a reta em torno da interseção com $y$ ( $V_{\max}$ inalterado, $K_m$ elevado); um não competitivo a gira em torno da interseção com $x$ ( $K_m$ inalterado, $V_{\max}$ reduzido).

Exemplo 13.10 (A competição como remédio)

O metanol é inofensivo até que a álcool-desidrogenase do fígado o transforme em formaldeído e em ácido fórmico, que cegam e matam. O tratamento é o etanol: um substrato concorrente de $K_m$ menor, que mantém a enzima ocupada enquanto o metanol é excretado sem alteração. As estatinas são inibidoras competitivas, parecidas com o estado de transição, da enzima que compromete carbono com o colesterol; as sulfonamidas se parecem com o substrato de uma enzima bacteriana que fabrica folato, que os humanos não fabricam e, portanto, não sentem falta.

13.4 Regulação

Definição 13.11 (Enzimas alostéricas)

Uma enzima alostérica tem várias subunidades e, além dos sítios ativos, sítios reguladores em que efetores se ligam: os ativadores a deslocam para a conformação ativa, e os inibidores para a inativa. A velocidade dela contra $[S]$ é sigmoide, e não hiperbólica (há cooperatividade entre os sítios ativos, como na hemoglobina, Capítulo 12), de modo que uma pequena variação de substrato perto da parte íngreme muda muito a velocidade; os efetores deslocam a curva para os lados (mudando a concentração de substrato necessária) ou para cima e para baixo (mudando a velocidade máxima). As enzimas alostéricas ficam nos pontos de ramificação do metabolismo, e os efetores são os próprios produtos da via e os sinais energéticos da célula (ATP, ADP, AMP).

Uma enzima alostérica. A curva sigmoide torna a velocidade sensível ao substrato perto do ponto médio; um ativador a desloca para a esquerda (mais ativa num dado [S]), e um inibidor para a direita. Perto de [S] = 3 a velocidade pode oscilar de um décimo a nove décimos do máximo. — Uma enzima alostérica. A curva sigmoide torna a velocidade sensível ao substrato perto do ponto médio; um ativador a desloca para a esquerda (mais ativa num dado $[S]$ ), e um inibidor para a direita. Perto de $[S] = 3$ a velocidade pode oscilar de um décimo a nove décimos do máximo.

Proposição 13.12 (Quatro maneiras de a célula controlar uma enzima)

Inibição por retroalimentação: o produto final de uma via é um inibidor alostérico da primeira enzima comprometida dela, de modo que a via corre apenas tão rápido quanto o produto é consumido (a isoleucina sobre a treonina-desaminase; o ATP sobre a fosfofrutoquinase, Capítulo 15). Tempo de resposta: milissegundos.
Modificação covalente: uma quinase prende um fosfato a uma serina, treonina ou tirosina da enzima, uma fosfatase o retira, e as duas formas diferem em atividade (a glicogênio-fosforilase é ligada pela fosforilação, e a glicogênio-sintase, desligada, pelo mesmo sinal hormonal). De segundos a minutos; reversível; amplificável em cascatas.
Ativação proteolítica: algumas enzimas são fabricadas como precursores inativos (os zimogênios: tripsinogênio, pepsinogênio, os fatores de coagulação) e ligadas pelo corte de um peptídeo, de uma vez por todas, onde e quando são necessárias.
Quantidade: a célula fabrica mais ou menos da enzima controlando o gene dela (Capítulo 20) e a degrada mais depressa ou mais devagar. De minutos a horas.

Exemplo 13.13 (Isoenzimas)

A lactato-desidrogenase existe em cinco formas, tetrâmeros de dois tipos de subunidade em todas as combinações; a forma do coração tem $K_m$ baixo para o lactato e é inibida pelo piruvato (ela oxida lactato para alimentar o ciclo de Krebs), e a do músculo tem $V_{\max}$ alto e tolera o piruvato (ela fabrica lactato numa disparada). O padrão de formas no sangue revela que órgão foi lesado — um infarto libera a do coração.

13.5 Temperatura e pH

Proposição 13.14 (As enzimas e o ambiente delas)

A velocidade de uma reação enzimática aproximadamente dobra a cada $10\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ( $Q_{10} \approx 2$ ), à medida que a energia térmica leva mais moléculas por cima da barreira, até que a enzima comece a se desdobrar ( $40\text{ to }60\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para a maioria; $100\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para as enzimas de bactérias de fontes termais) e a velocidade desabe. Cada enzima tem um pH ótimo, em que a ionização dos resíduos catalíticos dela e a do substrato estão certas: a pepsina, no estômago, perto de pH 2; a tripsina, no intestino, perto de 8; quase todas as enzimas intracelulares perto de 7. Longe do ótimo a velocidade cai, e muito longe dele a proteína desnatura. A temperatura e o pH agem sobre a proteína; a célula mantém as duas dentro da faixa em que as mil enzimas dela funcionam todas.

Exemplo 13.15 (Uma febre e uma fonte termal)

Uma febre de $40\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ acelera em um quarto todas as reações do corpo e começa a desdobrar as proteínas mais frágeis; a $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ as do encéfalo falham. A DNA-polimerase de uma bactéria de uma fonte a $75\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ sobrevive a $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , e é por isso que ela pode ser ciclada milhares de vezes pela fusão do DNA e virou a enzima da reação em cadeia da polimerase (o volume do Ano 3): a termoestabilidade é uma propriedade da sequência, e não da química catalisada.

13.6 Exercícios

Exercício 13.1 ★

O que uma enzima muda numa reação, e o que ela deixa inalterado? Ilustre com o perfil de energia.

Solução

Solução de Exercício 13.1.

Ela baixa a energia de ativação (a altura do estado de transição) e, com isso, a velocidade nos dois sentidos; ela deixa inalterados o $\Delta G$ , a constante de equilíbrio e a posição do equilíbrio. No perfil, o pico é rebaixado, e as duas pontas não.

Exercício 13.2 ★

Defina $K_m$ , $V_{\max}$ , $k_{\text{cat}}$ e $k_{\text{cat}}/K_m$ , com as unidades.

Solução

Solução de Exercício 13.2.

$K_m$ : concentração de substrato na metade de $V_{\max}$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ ). $V_{\max}$ : velocidade com substrato saturante ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , ou $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). $k_{\text{cat}}$ : moléculas de substrato convertidas por segundo e por enzima na saturação ( $\mathrm{s}^{-1}$ ). $k_{\text{cat}}/K_m$ : eficiência, a constante de velocidade de segunda ordem em substrato baixo ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ ).

Exercício 13.3 ★

A partir da figura de Lineweaver–Burk dos inibidores, leia $V_{\max}$ e $K_m$ para a enzima sem inibidor e para cada inibidor.

Solução

Solução de Exercício 13.3.

Sem inibidor: interseção 1, logo $V_{\max} = 1$ ; interseção em $x$ $-0.5$ , logo $K_m = 2$ . Competitivo: $V_{\max} = 1$ , interseção em $x$ $-0.25$ , $K_m = 4$ . Não competitivo: interseção 2, $V_{\max} = 0.5$ ; interseção em $x$ $-0.5$ , $K_m = 2$ .

Exercício 13.4 ★

Cite as quatro maneiras pelas quais uma célula regula a atividade de uma enzima e dê a escala de tempo de cada uma.

Solução

Solução de Exercício 13.4.

Regulação alostérica (por retroalimentação), milissegundos; modificação covalente (fosforilação), de segundos a minutos; ativação proteolítica de um zimogênio, uma única vez, sob demanda; controle da quantidade pela expressão gênica e pela degradação, de minutos a horas.

Exercício 13.5 ★★

Uma enzima tem $K_m = 0.1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ e $V_{\max} = 50\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . Calcule $v_0$ em $[S] = 0.02$ , $0.1$ , $1$ e $10\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Em que $[S]$ vale $v_0 = 0.9\,V_{\max}$ ?

Solução

Solução de Exercício 13.5.

$v_0 = 50[S]/(0.1 + [S])$ : 8.3, 25, 45.5 e $49.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . $0.9 = [S]/(0.1 + [S])$ dá $[S] = 0.9\,K_m/0.1 = 0.9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Exercício 13.6 ★★

Baixar o $E_a$ em $20\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplica a velocidade por qual fator? Quanto o $E_a$ precisa cair para ganhar um fator $10^{10}$ ?

Solução

Solução de Exercício 13.6.

$e^{20\,000/2580} = e^{7.75} = 2300$ . Para $10^{10}$ : $\Delta E_a = RT\ln 10^{10} = 2.58\times 23.0 = 59\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ .

Exercício 13.7 ★★

$2\,\mathrm{pmol}$ de anidrase carbônica em $1\,\mathrm{mL}$ dão $V_{\max} = 120\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ por minuto. Calcule o $k_{\text{cat}}$ e, com $K_m = 12\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , a eficiência. Compare com o limite da difusão.

Solução

Solução de Exercício 13.7.

$V_{\max} = 0.12\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ por minuto em $1\,\mathrm{mL}$ : $1.2 \times 10^{-4}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ $= 2.0 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ de produto; enzima $2 \times 10^{-12}\,\mathrm{mol}$ : $k_{\text{cat}} = 2\times 10^{-6}/2\times 10^{-12} = 1 \times 10^{6}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Eficiência $10^6/0.012 = 8 \times 10^{7}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , a menos de um fator dez do limite da difusão: quase todo encontro com uma molécula de substrato é produtivo.

Exercício 13.8 ★★

Um inibidor competitivo a $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ dobra o $K_m$ aparente. Calcule o $K_i$ . Que concentração de substrato restabelece a velocidade a $90\,\%$ de $V_{\max}$ com e sem o inibidor, se $K_m = 1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?

Solução

Solução de Exercício 13.8.

$1 + 2/K_i = 2$ : $K_i = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Para $90\,\%$ : $[S] = 9K_m^{\text{ap}}$ : $9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ sem o inibidor, $18\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ com ele.

Exercício 13.9 ★★

Explique por que a inibição por retroalimentação age na primeira etapa comprometida de uma via, e não na última, e por que o inibidor em geral é o produto final, e não um intermediário.

Solução

Solução de Exercício 13.9.

Inibir a primeira etapa comprometida detém a via inteira de uma vez e não desperdiça intermediários, que de outro modo se acumulariam; o produto final é o sinal que importa — a abundância dele é exatamente a informação de que a via já não é necessária —, ao passo que o nível de um intermediário nada diz sobre a demanda.

Exercício 13.10 ★★★

O tripsinogênio é ativado no intestino, e não no pâncreas que o fabrica; uma pequena fração ativada cedo demais destrói o pâncreas. Explique a lógica dos zimogênios, o papel da enzima que ativa o tripsinogênio, e por que o pâncreas também fabrica um inibidor de tripsina.

Solução

Solução de Exercício 13.10.

Uma protease ativa na célula que a fabrica digeriria essa célula; feita como zimogênio inativo, ela é inofensiva até que a enteropeptidase, uma enzima do revestimento intestinal, corte o tripsinogênio em tripsina no duodeno, onde a digestão é desejada; a tripsina então ativa os demais zimogênios (uma cascata). Como um traço de tripsina pode disparar a cascata prematuramente, o pâncreas empacota nos grânulos dele um inibidor específico de tripsina como seguro; a falha desse arranjo é a pancreatite.

Exercício 13.11 ★★★

Uma enzima alostérica com $n = 3$ e meia saturação em $[S]_{0.5} = 3$ tem a curva dela deslocada para $[S]_{0.5} = 5.5$ por um inibidor. Calcule a velocidade em $[S] = 3$ com e sem o inibidor, e compare com a mudança que um inibidor competitivo com o mesmo deslocamento de $K_m$ produziria numa enzima de Michaelis–Menten. O que a cooperatividade acrescenta à regulação?

Solução

Solução de Exercício 13.11.

Sem ele: $3^3/(3^3 + 3^3) = 0.50$ . Com ele: $27/(166 + 27) = 0.14$ : a velocidade cai a $28\,\%$ do valor dela. Uma enzima de Michaelis–Menten com o $K_m$ elevado de 3 para 5.5: de $3/6 = 0.50$ a $3/8.5 = 0.35$ , ou seja, $70\,\%$ . A cooperatividade torna o mesmo deslocamento da curva mais que duas vezes mais eficaz perto do ponto de trabalho: um interruptor, e não um dimmer.

Exercício 13.12 ★★★

“Uma enzima é um catalisador a quem disseram o que fazer.” Discuta em um parágrafo: catálise contra especificidade, a regulação como a informação acrescentada, e o custo de uma enzima regulada em comparação com um catalisador nu.

Solução

Solução de Exercício 13.12.

Um catalisador nu (uma superfície de platina, um ácido) acelera muitas reações indiscriminadamente; uma enzima acelera uma reação sobre um substrato — a especificidade do sítio ativo dela já é informação sobre o que a célula quer que seja feito. A regulação acrescenta uma segunda camada: os sítios alostéricos, os sítios de fosforilação e os peptídeos dos zimogênios dizem à enzima quando e onde agir, em resposta ao estado da célula. O custo é uma proteína grande (centenas de resíduos para um sítio de uma dúzia), uma renovação mais lenta que a dos melhores catalisadores inorgânicos, e a maquinaria para fabricá-la, modificá-la e destruí-la; o benefício é uma química que só funciona onde e quando é útil, que é o que um metabolismo é.

13.7 Problema: Uma enzima medida

Problema 13.1

Problema de fim de semana — uma esterase ensaiada em seis concentrações de substrato, sozinha e com dois inibidores, com as constantes dela extraídas e o comportamento dela na célula previsto, terminando no $K_m$ , no $V_{\max}$ e no $K_i$

Uma esterase é ensaiada em $1.0\,\mathrm{mL}$ a $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , pH 7.5, com $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ de enzima. As velocidades iniciais ( $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ) em seis concentrações de substrato, sozinha e na presença de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ do inibidor I ou de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ do inibidor J:

$[S]$ ( $\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ )	0.5	1	2	5	10	20
$v_0$ , sem inibidor	0.200	0.333	0.500	0.714	0.833	0.909
$v_0$ , com I	0.111	0.200	0.333	0.556	0.714	0.833
$v_0$ , com J	0.100	0.167	0.250	0.357	0.417	0.455

Parte I — A enzima sozinha.

Calcule $1/[S]$ e $1/v_0$ para os seis pontos sem inibidor.
Mostre que os pontos ficam sobre uma reta e encontre a inclinação e a interseção dela.
Deduza $V_{\max}$ e $K_m$ .
Verifique com a equação de Michaelis–Menten em $[S] = 5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .
Calcule a quantidade de enzima do ensaio (em mols) e o $k_{\text{cat}}$ em $\mathrm{s}^{-1}$ .
Calcule $k_{\text{cat}}/K_m$ e compare com o limite da difusão.
Em que concentração de substrato a enzima trabalha a $95\,\%$ de $V_{\max}$ ?

Parte II — O inibidor I.

Calcule $1/v_0$ para os seis pontos com I e encontre a inclinação e a interseção da reta deles.
Deduza o $V_{\max}$ e o $K_m$ aparentes com I.
Qual parâmetro mudou? Classifique o inibidor.
Calcule o $K_i$ a partir de $K_m^{\text{ap}} = K_m(1 + [I]/K_i)$ .
Em $[S] = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , que concentração de I reduz a velocidade à metade? E em $[S] = 20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?
Proponha o que I pode ser, estruturalmente, e onde ele se liga.

Parte III — O inibidor J.

Calcule a inclinação e a interseção da reta com J e deduza o $V_{\max}$ e o $K_m$ aparentes.
Classifique J e calcule o $K_i$ dele a partir de $V_{\max}^{\text{ap}} = V_{\max}/(1 + [J]/K_i)$ .
Explique por que aumentar o substrato não vence J.
Dobrar a concentração de enzima na presença de J faz o quê com a velocidade? E na presença de I?

Parte IV — Na célula. A célula mantém o substrato a $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ e a enzima a $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ num volume de $1000\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , com $Q_{10} = 2$ .

Calcule a velocidade na célula (moléculas de produto por segundo na célula inteira).
O produto é necessário a $3 \times 10^{6}\,$ moléculas por segundo. Por qual fator a célula precisa elevar a velocidade, e cite duas maneiras de fazê-lo.
O produto é um inibidor competitivo da enzima com $K_i = 0.2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , e se acumula a $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calcule então a velocidade e comente o que isso realiza.
A enzima é fosforilada por uma quinase, o que baixa o $K_m$ dela para $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calcule a velocidade em $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de substrato antes e depois.
O pH ótimo da enzima é 7.5 e a atividade dela cai à metade em pH 6.5. Um lisossomo está em pH 5. Preveja, qualitativamente, a atividade dela ali e explique em termos de resíduos ionizáveis.
Uma mutação substitui a histidina do sítio ativo por alanina. Preveja o efeito sobre o $K_m$ e sobre o $k_{\text{cat}}$ , com uma razão para cada um.
Explique por que a célula mantém o substrato perto do $K_m$ , e não muito acima dele.
Enuncie o resultado: $K_m$ , $V_{\max}$ e $k_{\text{cat}}$ da esterase, e o tipo e o $K_i$ de cada inibidor.

Solução

Solução de Problema 13.1.

1. $1/[S]$ : 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05. $1/v_0$ : 5.0, 3.0, 2.0, 1.4, 1.2, 1.1. 2. Cada passo de $1/[S]$ muda $1/v_0$ na mesma proporção: inclinação $(5.0 - 1.1)/(2 - 0.05) = 2.0$ ; interseção $1.0$ . 3. $V_{\max} = 1/1.0 = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ; $K_m = \text{inclinação}\times V_{\max} = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 4. $1.0\times 5/(2 + 5) = 0.714$ : como medido. 5. $10 \times 10^{-9}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}\times1 \times 10^{-3}\,\mathrm{L} = 1 \times 10^{-11}\,\mathrm{mol}$ ; $V_{\max} = 1 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min} = 1.67 \times 10^{-8}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ ; $k_{\text{cat}} = 1.67\times 10^{-8}/10^{-11} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ . 6. $1670/(2\times 10^{-3}) = 8.3 \times 10^{5}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ : mil vezes abaixo do limite da difusão; só uma colisão em mil é produtiva. 7. $0.95 = [S]/(2 + [S])$ : $[S] = 19\,K_m = 38\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 8. $1/v_0$ : 9.0, 5.0, 3.0, 1.8, 1.4, 1.2. Inclinação $(9.0 - 1.2)/1.95 = 4.0$ ; interseção $1.0$ . 9. $V_{\max}^{\text{ap}} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (inalterado); $K_m^{\text{ap}} = 4.0\times 1.0 = 4.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 10. $K_m$ dobrado, $V_{\max}$ inalterado: competitivo. 11. $4 = 2(1 + 1/K_i)$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 12. Com o inibidor, $v = V_{\max}[S]/(K_m(1 + [I]/K_i) + [S])$ ; reduzir a velocidade à metade exige $K_m(1 + [I]/K_i) + [S] = 2(K_m + [S])$ , ou seja, $[I] = K_i(K_m + [S])/K_m$ : a $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 1\times 4/2 = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; a $20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 22/2 = 11\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Quanto mais substrato, mais inibidor é preciso. 13. Uma molécula parecida com o substrato (ou com o estado de transição dele) — um análogo de éster que não pode ser hidrolisado — que se liga no sítio ativo. 14. $1/v_0$ : 10.0, 6.0, 4.0, 2.8, 2.4, 2.2; inclinação $4.0$ , interseção $2.0$ : $V_{\max}^{\text{ap}} = 0.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , $K_m^{\text{ap}} = 4.0\times 0.5 = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 15. $V_{\max}$ reduzido à metade, $K_m$ inalterado: não competitivo; $2 = 1 + 1/K_i$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 16. J se liga a um sítio diferente do ativo, tanto na enzima livre quanto no $ES$ , com a mesma afinidade: o substrato não compete com ele, e em qualquer $[S]$ metade das moléculas de enzima fica inativada. 17. Com J a velocidade dobra (metade de uma quantidade dobrada de enzima continua ativa); com I ela também dobra (a velocidade é proporcional à enzima em todo $[S]$ ): dobrar a enzima nunca distingue os dois inibidores. 18. Velocidade a $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $V_{\max}[S]/(K_m + [S])$ com $V_{\max} = k_{\text{cat}}[E]$ : por litro, $1670\times 10^{-8} = 1.67 \times 10^{-5}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; $\times 0.5/2.5 = 3.3 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $\times 2^{1.2} = 2.3$ : $7.7 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; em $1 \times 10^{-12}\,\mathrm{L}$ : $7.7 \times 10^{-18}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ $= 4.6 \times 10^{6}$ moléculas por segundo. 19. Não é preciso elevar: a velocidade ( $4.6 \times 10^{6}$ ) supera a demanda ( $3 \times 10^{6}$ ); se fosse preciso elevá-la, a célula poderia aumentar o substrato, ou fosforilar a enzima para baixar o $K_m$ dela, ou fabricar mais enzima. 20. $K_m^{\text{ap}} = 2(1 + 0.4/0.2) = 6\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ : velocidade $\times 0.5/6.5$ em vez de $0.5/2.5$ : $38\,\%$ do valor anterior, $1.8 \times 10^{6}$ por segundo — o produto estrangula a própria síntese até abaixo da demanda, de modo que ele é consumido e o nível dele cai, o que libera a enzima: um suprimento que se autorregula. 21. Antes: $0.5/2.5 = 0.20$ de $V_{\max}$ ; depois: $0.5/0.9 = 0.56$ : quase o triplo. 22. Quase nula: em pH 5 a histidina do sítio ativo está protonada e não consegue agir como base, e os resíduos ácidos do sítio estão neutralizados; o estado de ionização da enzima, e talvez o enovelamento dela, estão errados. Ela é feita para o citosol, e não para o lisossomo. 23. O $K_m$ muda pouco (a ligação se deve em grande parte ao resto do sítio); o $k_{\text{cat}}$ desaba por ordens de grandeza, já que a histidina era a base catalítica que ativava a água ou a serina. 24. Perto do $K_m$ a velocidade responde às variações de substrato (inclinação próxima de $V_{\max}/2K_m$ ); muito acima dele a enzima fica saturada e insensível, e o excesso de substrato seria um fardo osmótico e químico. Trabalhar perto do $K_m$ torna a via controlável pela oferta. 25. $K_m = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $V_{\max} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (enzima a $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k_{\text{cat}} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ ; I é competitivo, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; J é não competitivo, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

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