Biology · Livro 3 · Bachelor Year 1

Biologia universitária — 1.º ano

Biologia universitária — 1.º ano · Bachelor Year 1

11Nucleotídeos e ácidos nucleicos

Despeje etanol gelado sobre uma solução de células rompidas e aparece uma nuvem branca de fibras que pode ser enrolada num bastão de vidro: o DNA, a molécula que carrega cada instrução do organismo, visível a olho nu. Dois metros dele estão dobrados dentro de cada núcleo humano; ele inteiro é escrito num alfabeto de quatro letras, lido num único sentido, e copiado pela separação de duas fitas que se encaixam como uma mão e a luva dela. Este capítulo descreve os nucleotídeos — letras, moeda energética e coenzimas ao mesmo tempo —, as cadeias que eles formam, a dupla-hélice e as evidências dela, o que acontece quando ela é fundida e reassociada, e os RNAs que levam a mensagem dela para dentro da célula.

11.1 Nucleotídeos

Definição 11.1 (Nucleotídeo)

Um nucleotídeo é feito de três partes: uma base nitrogenada — uma purina (adenina A, guanina G: dois anéis fundidos) ou uma pirimidina (citosina C, timina T, uracila U: um anel); um açúcar de cinco carbonos, a ribose no RNA ou a 2′'-desoxirribose no DNA (sem a hidroxila do carbono 2′2'); e de um a três grupos fosfato no carbono 5′5' do açúcar. A base é ligada ao carbono 1′1'; os carbonos do açúcar são numerados com linhas para distingui-los dos da base. Base mais açúcar formam um nucleosídeo (adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina); com fosfatos, um nucleotídeo (AMP, ADP, ATP e os parentes deles).

As partes de um nucleotídeo: uma base no carbono 1' de uma pentose, fosfatos no carbono 5'. A hidroxila 3' é onde o nucleotídeo seguinte de uma cadeia vai se ligar; a posição 2' distingue o RNA (OH) do DNA (H).
As partes de um nucleotídeo: uma base no carbono 1′1' de uma pentose, fosfatos no carbono 5′5'. A hidroxila 3′3' é onde o nucleotídeo seguinte de uma cadeia vai se ligar; a posição 2′2' distingue o RNA (OH) do DNA (H).

Proposição 11.2 (Os nucleotídeos fazem três trabalhos)

Além de serem os monômeros do DNA e do RNA, os nucleotídeos são a moeda energética da célula — o ATP e o GTP, cujas ligações fosfoanidrido (Capítulo 8) pagam pela síntese, pelo transporte e pelo movimento; as coenzimas dela — NAD+\mathrm{NAD^+}, NADP+\mathrm{NADP^+} e FAD, que carregam elétrons na respiração e na fotossíntese (Capítulo 15), e a coenzima A, que carrega grupos acila; e os mensageiros dela — o AMP cíclico, que retransmite sinais hormonais dentro das células. Todos eles são nucleotídeos de adenina ou são construídos sobre eles: a mesma molécula que escreve a mensagem alimenta a execução dela.

11.2 A cadeia polinucleotídica

Definição 11.3 (Ligação fosfodiéster, polaridade)

Os nucleotídeos são unidos num polinucleotídeo por ligações fosfodiéster: o fosfato do carbono 5′5' de um nucleotídeo é ligado à hidroxila 3′3' do seguinte. A cadeia tem, portanto, um esqueleto de açúcar e fosfato, uniforme e carregado negativamente (uma carga por fosfato), do qual as bases se projetam como uma sequência; e ela tem um sentido: uma extremidade 5′5' com um fosfato livre e uma extremidade 3′3' com uma hidroxila livre. As sequências são escritas e lidas de 5′→3′5' \to 3', o sentido em que as cadeias são sintetizadas. O DNA (ácido desoxirribonucleico) usa desoxirribose e as bases A, G, C, T; o RNA (ácido ribonucleico) usa ribose e A, G, C, U.

Uma cadeia de quatro nucleotídeos. O fosfato 5' de cada nucleotídeo é unido à hidroxila 3' do de cima por uma ligação fosfodiéster; a cadeia vai de uma extremidade 5' a uma extremidade 3' e as bases pendem de um esqueleto uniforme.
Uma cadeia de quatro nucleotídeos. O fosfato 5′5' de cada nucleotídeo é unido à hidroxila 3′3' do de cima por uma ligação fosfodiéster; a cadeia vai de uma extremidade 5′5' a uma extremidade 3′3' e as bases pendem de um esqueleto uniforme.

Exemplo 11.4 (O RNA é frágil, o DNA é durável)

A hidroxila 2′2' da ribose pode atacar a ligação fosfodiéster vizinha: em álcali brando o RNA é hidrolisado a nucleotídeos em poucas horas, ao passo que o DNA, que não tem essa hidroxila, sobrevive à fervura em álcali e já foi recuperado intacto de ossos com dezenas de milhares de anos. A uracila do RNA é a timina sem o grupo metila; o DNA usa timina para que a citosina, que lentamente perde o grupo amino e vira uracila, possa ser reconhecida como danificada e reparada — uma uracila no DNA é sempre um erro.

11.3 A dupla-hélice

Proposição 11.5 (As regras de Chargaff)

No DNA de qualquer organismo a quantidade de adenina é igual à de timina e a de guanina é igual à de citosina (A=TA = T, G=CG = C, e portanto purinas == pirimidinas), ao passo que a razão (G+C)/(A+T)(G + C)/(A + T) varia de espécie para espécie (de 25 %25\,\% a 75 %75\,\% de G+CG + C).

Evidências. Chargaff (1950) hidrolisou DNA de muitos organismos e separou as bases por cromatografia, medindo cada uma pela absorção no ultravioleta. As igualdades valeram dentro do erro experimental para todo DNA; o teor de G+CG + C não, e ele era o mesmo em todos os tecidos de um mesmo organismo. ∎

Teorema 11.6 (A dupla-hélice de Watson e Crick)

O DNA são duas cadeias polinucleotídicas enroladas em torno de um eixo comum numa dupla-hélice destra: os esqueletos de açúcar e fosfato por fora, as bases por dentro, planas e empilhadas perpendicularmente ao eixo. As cadeias são antiparalelas (uma corre de 5′→3′5' \to 3' para cima, a outra para baixo) e complementares: em frente a cada A há um T, seguro por duas ligações de hidrogênio, e em frente a cada G um C, seguro por três; cada um desses pares de bases tem a mesma largura, de modo que a hélice é uniforme seja qual for a sequência. Na forma B, a comum, a hélice tem 2 nm2\,\mathrm{nm} de diâmetro, sobe 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par de bases e 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} por volta de dez pares, e mostra um sulco maior largo e um sulco menor estreito, em que as bordas das bases ficam expostas às proteínas.

Evidências. As imagens de difração de raios X de fibras de DNA obtidas por Franklin (1952) mostravam a cruz de uma hélice com repetição de 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} ao longo do eixo, uma reflexão forte a 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} (unidades planas empilhadas) e um diâmetro de 2 nm2\,\mathrm{nm}; os fosfatos, os átomos mais pesados, tinham de estar por fora. Watson e Crick (1953) descobriram que uma purina pareada com uma pirimidina — e apenas A com T e G com C — dá pares de largura igual, que cabem no diâmetro de 2 nm2\,\mathrm{nm}, explicando as regras de Chargaff, e que duas cadeias antiparalelas assim pareadas constroem uma hélice regular com as dimensões da fibra. O modelo previa que cada cadeia é molde da outra; a demonstração da replicação semiconservativa por Meselson e Stahl (retomada do volume do Ensino Médio, e no Capítulo 18) o confirmou. ∎

À esquerda: um modelo da dupla-hélice; os dois esqueletos se enrolam em torno dos pares de bases empilhados, deixando um sulco maior e um sulco menor. À direita: os mesmos dez pares de bases desenrolados numa escada: fitas antiparalelas, pares complementares de largura igual, 0.34\, nm por par e 3.4\, nm por volta.
À esquerda: um modelo da dupla-hélice; os dois esqueletos se enrolam em torno dos pares de bases empilhados, deixando um sulco maior e um sulco menor. À direita: os mesmos dez pares de bases desenrolados numa escada: fitas antiparalelas, pares complementares de largura igual, 0.34\, nm por par e 3.4\, nm por volta.
À esquerda: um modelo da dupla-hélice; os dois esqueletos se enrolam em torno dos pares de bases empilhados, deixando um sulco maior e um sulco menor. À direita: os mesmos dez pares de bases desenrolados numa escada: fitas antiparalelas, pares complementares de largura igual, 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par e 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} por volta.

Exemplo 11.7 (Ler uma fita)

Se uma fita lê 5′5'-ATGGCATTC-3′3', a parceira dela, escrita de 5′→3′5' \to 3', é 5′5'-GAATGCCAT-3′3': complemente cada base e depois inverta a ordem. Nove pares, 3.1 nm3.1\,\mathrm{nm} de hélice, vinte e duas ligações de hidrogênio (cinco G–C, quatro A–T). Um cromossomo humano de 2.5×1082.5 \times 10^{8} pares tem 8.5 cm8.5\,\mathrm{cm} de comprimento nessa forma e precisa ser dobrado cem mil vezes para caber num núcleo (Capítulo 17).

Proposição 11.8 (O que mantém a hélice unida)

As ligações de hidrogênio entre as bases pareadas dão a especificidade; o empilhamento das bases planas umas sobre as outras — contatos de van der Waals e o efeito hidrofóbico, que mantém as bases fora da água — dá a maior parte da estabilidade; os esqueletos carregados negativamente se repelem, e a hélice só é estável na presença de cátions (o Mg2+\mathrm{Mg^{2+}} e o Na+\mathrm{Na^+} fisiológicos, ou as proteínas básicas da cromatina) que blindem a carga. Um par G–C, com três ligações de hidrogênio e empilhamento mais forte, segura melhor que um par A–T.

11.4 Fusão e hibridização

Definição 11.9 (Desnaturação, temperatura de fusão)

O aquecimento, ou um pH extremo, separa as duas fitas do DNA: é a desnaturação (fusão), uma transição cooperativa ao longo de poucos graus, cujo ponto médio é a temperatura de fusão TmT_m. Ela é acompanhada do efeito hipercrômico: as fitas simples absorvem cerca de 40 %40\,\% mais luz ultravioleta a 260 nm260\,\mathrm{nm} que as mesmas bases empilhadas numa hélice. O TmT_m sobe com o teor de G+CG + C (0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} por ponto percentual), com a concentração de sal e com o comprimento; em sal a 0.15 mol/L0.15\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}, um DNA longo com 50 %50\,\% de G+CG + C funde perto de 90 ∘C90\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Resfriadas devagar, as fitas encontram as complementares e refazem a hélice: é a renaturação, ou hibridização quando as fitas vêm de fontes diferentes.

Curvas de fusão de dois DNAs no mesmo sal. A absorbância sobe 40\,\% à medida que as fitas se separam, ao longo de poucos graus; o ponto médio, T_m, é maior para o DNA mais rico em pares G–C.
Curvas de fusão de dois DNAs no mesmo sal. A absorbância sobe 40 %40\,\% à medida que as fitas se separam, ao longo de poucos graus; o ponto médio, TmT_m, é maior para o DNA mais rico em pares G–C.

Método 11.10 (Medir ácidos nucleicos pela absorbância)

  1. As bases absorvem luz ultravioleta com máximo em 260 nm260\,\mathrm{nm}. Numa cubeta de 1 cm1\,\mathrm{cm}, uma absorbância de 1.01.0 corresponde a 50 µg/mL50\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de DNA de fita dupla (40 µg/mL40\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de RNA, 33 µg/mL33\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} de DNA de fita simples).
  2. A razão A260/A280A_{260}/A_{280} é 1.81.8 para DNA puro e 2.02.0 para RNA puro; as proteínas absorvem a 280 nm280\,\mathrm{nm} e a diminuem.
  3. Para acompanhar a fusão, registre A260A_{260} enquanto aquece devagar; o ponto médio da curva é o TmT_m e a inclinação dela é uma medida da homogeneidade da amostra.
  4. Para detectar uma sequência, desnature a amostra e acrescente uma fita simples marcada, complementar a ela (uma sonda); ela hibridiza só onde está a complementar dela, e a marcação assinala o lugar — num gel, num cromossomo, num tecido.
DNA precipitado por etanol gelado a partir de um lisado celular e enrolado num bastão de vidro: alguns miligramas da molécula, visíveis como fibras porque cada uma tem milhões de pares de bases de comprimento.
DNA precipitado por etanol gelado a partir de um lisado celular e enrolado num bastão de vidro: alguns miligramas da molécula, visíveis como fibras porque cada uma tem milhões de pares de bases de comprimento.

Exemplo 11.11 (Uma sonda encontra um gene)

Uma sonda de vinte nucleotídeos complementar a um gene, a 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C} abaixo do TmT_m dela, liga-se à complementar exata dela e a mais nada em três bilhões de pares de bases: um único descasamento em vinte baixa o TmT_m em vários graus e o híbrido descasado funde. A especificidade do pareamento de bases, multiplicada por vinte posições, é aquilo em que se apoia todo teste de DNA, do exame de paternidade à detecção de patógenos.

11.5 RNA

Definição 11.12 (Os RNAs)

O RNA em geral tem fita simples e se dobra sobre si mesmo onde quer que trechos complementares curtos permitam, formando grampos, alças e protuberâncias — uma estrutura secundária — que depois se compacta numa forma. Três classes carregam o fluxo da informação genética (Capítulo 19): o RNA mensageiro (mRNA), uma cópia de um gene que o ribossomo lê; o RNA transportador (tRNA), com cerca de 75 75\, nucleotídeos dobrados numa folha de trevo, que carrega um aminoácido na extremidade 3′3' dele e um anticódon que pareia com a mensagem; e o RNA ribossômico (rRNA), o núcleo estrutural e catalítico do ribossomo, quatro quintos do RNA de uma célula. Muitos outros RNAs regulam, fazem splicing e guiam (o volume do Ano 3).

Um RNA transportador na estrutura secundária em folha de trevo: uma fita simples de cerca de 75 nucleotídeos pareada consigo mesma em quatro hastes. O aminoácido é carregado na extremidade 3'; o anticódon, na ponta oposta, lê a mensagem.
Um RNA transportador na estrutura secundária em folha de trevo: uma fita simples de cerca de 75 nucleotídeos pareada consigo mesma em quatro hastes. O aminoácido é carregado na extremidade 3′3'; o anticódon, na ponta oposta, lê a mensagem.

Observação 11.13 (O RNA pode ser catalisador)

Alguns RNAs são enzimas (as ribozimas): a ligação peptídica de toda proteína é formada pelo RNA ribossômico, e não por uma proteína, e alguns RNAs cortam e emendam a si mesmos. Uma molécula que ao mesmo tempo carrega informação e catalisa reações é do que um primeiro sistema vivo pode ter sido feito; o mundo do DNA e das proteínas seria então uma divisão de trabalho posterior, com o RNA mantido no centro dela.

11.6 Exercícios

Exercício 11.1 ★

Cite as três partes de um nucleotídeo e as duas diferenças entre um ribonucleotídeo e um desoxirribonucleotídeo.

Solução

Solução de Exercício 11.1.

Uma base nitrogenada, uma pentose, de um a três fosfatos. RNA: ribose (com uma hidroxila 2′2') e uracila; DNA: 2′2'-desoxirribose e timina.

Exercício 11.2 ★

Escreva a fita complementar de 5′5'-GGATCCTA-3′3' no sentido 5′→3′5' \to 3', e conte as ligações de hidrogênio dela.

Solução

Solução de Exercício 11.2.

5′5'-TAGGATCC-3′3'. Pares: G–C, G–C, A–T, T–A, C–G, C–G, T–A, A–T: quatro G–C (12 ligações) e quatro A–T (8): 20 ligações de hidrogênio.

Exercício 11.3 ★

Um DNA contém 22 %22\,\% de adenina. Dê as porcentagens de T, G e C, e o teor de G+CG + C.

Solução

Solução de Exercício 11.3.

T 22 %22\,\%; G e C dividem os 56 %56\,\% restantes: 28 %28\,\% cada; G+C=56 %G + C = 56\,\%.

Exercício 11.4 ★

A partir da figura da fusão, qual é o TmT_m de um DNA com 50 %50\,\% de G+CG + C nas mesmas condições, e quanto a absorbância sobe na fusão?

Solução

Solução de Exercício 11.4.

Entre as duas curvas, a 0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} por ponto percentual: cerca de 85 ∘C85\,{}^{\circ}\mathrm{C}. A absorbância sobe 40 %40\,\%.

Exercício 11.5 ★★

Calcule o comprimento do cromossomo da E. coli (4.6×1064.6 \times 10^{6} pares de bases) em milímetros, o número de voltas dele, e o fator pelo qual ele precisa ser compactado para caber numa célula de 2 µm2\,\text{µ}\mathrm{m}.

Solução

Solução de Exercício 11.5.

4.6×106×0.34 nm=1.56 mm4.6 \times 10^{6}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 1.56\,\mathrm{mm}; 460 000460\,000 voltas; 1560/2=7801560/2 = 780 vezes em comprimento (o cromossomo é dobrado em alças e super-hélices).

Exercício 11.6 ★★

Explique por que as duas fitas do DNA precisam ser antiparalelas, usando a geometria do esqueleto de açúcar e fosfato e a exigência de que todo par de bases tenha a mesma largura.

Solução

Solução de Exercício 11.6.

As bases pareiam com as bordas voltadas uma para a outra, e o açúcar de cada uma fica preso do mesmo lado do par apenas se os dois esqueletos correrem em sentidos opostos; com fitas paralelas os dois açúcares ficariam em bordas opostas, e a largura do par, e a posição do esqueleto, variariam com a sequência. Fitas antiparalelas com pares purina–pirimidina dão os 2 nm2\,\mathrm{nm} constantes que o padrão da fibra exige.

Exercício 11.7 ★★

Uma solução de DNA tem A260=0.35A_{260} = 0.35 numa cubeta de 1 cm1\,\mathrm{cm} e A280=0.20A_{280} = 0.20. Calcule a concentração e comente a pureza. Quantos pares de bases há em 1 mL1\,\mathrm{mL}, se a massa média de um par for 650 Da650\,\mathrm{Da}?

Solução

Solução de Exercício 11.7.

0.35×50=17.5 µg/mL0.35\times 50 = 17.5\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}. A260/A280=1.75A_{260}/A_{280} = 1.75: DNA essencialmente puro (1.8), talvez com um traço de proteína. Em 1 mL1\,\mathrm{mL}: 17.5×10−6/(650×1.66×10−24)=1.6×101617.5\times 10^{-6}/(650\times 1.66\times 10^{-24}) = 1.6 \times 10^{16} pares de bases.

Exercício 11.8 ★★

Explique o efeito hipercrômico e por que a curva de fusão de um DNA puro é íngreme, ao passo que a de uma mistura de DNAs de muitas espécies é espalhada.

Solução

Solução de Exercício 11.8.

As bases empilhadas se protegem umas às outras e absorvem menos; separar as fitas expõe cada base à luz e a absorbância sobe 40 %40\,\%. Um DNA puro funde dentro de poucos graus em torno do TmT_m único dele, de modo cooperativo; uma mistura contém DNAs de muitos teores de G+CG + C, cada um com o próprio TmT_m, de modo que a soma das curvas deles se espalha por dezenas de graus.

Exercício 11.9 ★★

Uma sonda de vinte nucleotídeos tem Tm=62 ∘CT_m = 62\,{}^{\circ}\mathrm{C} com a complementar exata dela; um descasamento baixa o TmT_m em cerca de 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Em que temperatura a hibridização deve ser feita para detectar a sequência exata e rejeitar descasamentos únicos? O que acontece a 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C}?

Solução

Solução de Exercício 11.9.

Logo abaixo de 62 ∘C62\,{}^{\circ}\mathrm{C} e acima de 57 ∘C57\,{}^{\circ}\mathrm{C}, digamos 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C}: o híbrido perfeito se mantém, e o descasado funde. A 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C} os híbridos com até três descasamentos são estáveis e a sonda também acende sequências aparentadas.

Exercício 11.10 ★★★

As regras de Chargaff valem para o DNA de fita dupla, mas não para o RNA nem para o DNA de certos vírus pequenos. Explique o que cada exceção diz sobre a estrutura desses ácidos nucleicos.

Solução

Solução de Exercício 11.10.

As regras decorrem do pareamento de bases entre duas fitas complementares. O RNA, de fita simples, não tem parceira que restrinja a composição dele, de modo que A≠UA \neq U em geral; os vírus pequenos em questão têm genomas de DNA de fita simples, que também não precisam obedecer às regras — e o descumprimento delas foi uma das primeiras pistas de que esses genomas eram de fita simples.

Exercício 11.11 ★★★

Duas ligações de hidrogênio seguram um par A–T, e no entanto uma hélice de mil pares A–T é estável a 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C}, ao passo que um par isolado nem chega a se formar. Explique com as ideias do Capítulo 8 (ligações fracas, cooperatividade, empilhamento), e diga o que isso implica para a fidelidade de uma sonda.

Solução

Solução de Exercício 11.11.

Cada par sozinho vale alguns quilojoules por mol, menos que a agitação térmica, e se forma e se rompe em microssegundos. Numa hélice os pares se formam juntos: cada par se empilha sobre o anterior e os primeiros pares nucleiam os demais, de modo que as energias se somam e a probabilidade de todos se romperem de uma vez é desprezível — é a cooperatividade. O empilhamento contribui tanto quanto as ligações de hidrogênio. Para uma sonda isso significa que a estabilidade cresce com o comprimento e cai bruscamente a cada descasamento, que interrompe a sequência cooperativa: a especificidade é uma propriedade do trecho inteiro.

Exercício 11.12 ★★★

“A estrutura do DNA é a explicação da hereditariedade.” Discuta em um parágrafo: o que a dupla-hélice explica de imediato (a cópia, a mutação como mudança de sequência), o que ela não explica sozinha (como a sequência vira uma proteína), e por que o modelo de Watson e Crick foi aceito antes de qualquer teste bioquímico dele.

Solução

Solução de Exercício 11.12.

A hélice explica a cópia de imediato: cada fita especifica a outra, de modo que separá-las e parear nucleotídeos novos em cada uma dá duas moléculas idênticas; uma mutação é uma base errada fixada numa cópia e fielmente copiada dali em diante. Ela não diz, sozinha, como uma sequência de quatro bases especifica uma proteína — isso levou uma década (código, mRNA, tRNA, ribossomo). O modelo foi aceito porque se encaixava em todas as medidas (Chargaff, as dimensões dos raios X, a densidade) sem sobrar nada, e porque a explicação que ele dava da hereditariedade era tão econômica que a alternativa — uma coincidência — era implausível; Meselson e Stahl confirmaram depois a cópia que ele previa.

11.7 Problema: O genoma de um vírus

Problema 11.1

Problema de fim de semana — o DNA do fago λ\lambda medido, pesado, contado, fundido e empacotado no capsídeo dele, terminando na temperatura de fusão e no comprimento de contorno dele

O genoma do bacteriófago λ\lambda é um único DNA linear de fita dupla com 48 50248\,502 pares de bases e teor de G+CG + C de 49.9 %49.9\,\%. Ele é empacotado num capsídeo icosaédrico de 55 nm55\,\mathrm{nm} de diâmetro interno. Tome 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} por par de bases, 2.0 nm2.0\,\mathrm{nm} para o diâmetro da hélice, 650 Da650\,\mathrm{Da} por par de bases, e Tm=81.5+16.6log⁡10[Na+]+0.41 (% G+C)−500/LT_m = 81.5 + 16.6\log_{10}[\mathrm{Na^+}] + 0.41\,(\%\,G{+}C) - 500/L em graus Celsius, com [Na+][\mathrm{Na^+}] em mol/L\mathrm{mol}/\mathrm{L} e LL o comprimento em pares de bases.

Parte I — Medido e pesado.

  1. Calcule o comprimento de contorno da molécula em micrômetros.
  2. Calcule o número de voltas da hélice.
  3. Calcule a massa molar dela em dáltons.
  4. Calcule a massa de uma molécula em gramas.
  5. Calcule o número de grupos fosfato e, portanto, a carga líquida da molécula.
  6. Calcule o número de nucleotídeos de cada base (A, T, G, C).
  7. Calcule o número total de ligações de hidrogênio que seguram as duas fitas.

Parte II — Fundido.

  1. Calcule o TmT_m em sódio a 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}.
  2. Calcule o TmT_m em sódio a 0.01 mol/L0.01\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} e explique por que o sal estabiliza a hélice.
  3. O genoma de λ\lambda contém uma região de 1000 1000\, pares com 35 %35\,\% de G+CG + C e outra com 62 %62\,\%. Calcule o TmT_m de cada região em sódio a 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} e descreva a forma da curva de fusão da molécula inteira.
  4. Uma solução de DNA de λ\lambda tem A260=0.50A_{260} = 0.50 antes da fusão. Qual é a concentração dela, e quanto valerá A260A_{260} depois da fusão completa?
  5. Quantas moléculas de λ\lambda há em 1 mL1\,\mathrm{mL} dessa solução?
  6. As duas extremidades do genoma de λ\lambda são saliências de fita simples de 12 nucleotídeos, complementares entre si, pelas quais a molécula se circulariza no hospedeiro. Calcule o TmT_m delas (use L=12L = 12) e diga por que, apesar disso, o círculo se mantém a 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} dentro da célula.

Parte III — Empacotado.

  1. Calcule o volume do DNA como um cilindro.
  2. Calcule o volume interno do capsídeo.
  3. Que fração do capsídeo o DNA preenche? Compare com o empacotamento mais compacto de cilindros paralelos (91 %91\,\%).
  4. O DNA carrega 97 00097\,000 cargas negativas numa esfera de 55 nm55\,\mathrm{nm}. Explique o que precisa acompanhar o DNA para dentro do capsídeo, e por que o DNA empacotado exerce sobre a casca uma pressão (dezenas de atmosferas) que ajuda a injetá-lo numa bactéria.
  5. A molécula precisa ser dobrada em alças de raio comparável ao do capsídeo. O DNA resiste ao dobramento abaixo de um raio de cerca de 50 nm50\,\mathrm{nm}. Comente.

Parte IV — Lido.

  1. Uma fita do genoma começa por 5′5'-GGGCGGCGACCT-3′3'. Escreva a fita complementar de 5′→3′5' \to 3'.
  2. Se um gene de 12001200 pares de bases for transcrito num mRNA, qual é o comprimento do mRNA em nucleotídeos e, a 330 Da330\,\mathrm{Da} por nucleotídeo, a massa dele?
  3. O genoma tem 75 75\, genes em 48 50248\,502 pares. Que fração do genoma é codificante, se o gene médio tiver 600600 pares? Compare com um genoma humano (1.5 %1.5\,\%).
  4. O genoma é replicado em 20 min20\,\mathrm{min} a 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} pelas enzimas do hospedeiro. Calcule a velocidade em pares de bases por segundo, se a replicação começar numa única origem e prosseguir nos dois sentidos.
  5. Quantas ligações de hidrogênio são rompidas por segundo nas duas forquilhas durante a replicação (use a média por par da questão 7)?
  6. Uma mutação muda um par G–C em A–T. Quanto muda o TmT_m da molécula inteira? A fusão conseguiria detectá-la?
  7. Enuncie o resultado: a temperatura de fusão do DNA de λ\lambda em sódio a 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} e o comprimento de contorno dele, e a compactação que o faz caber no capsídeo.
Solução

Solução de Problema 11.1.

1. 48 502×0.34=16 490 nm=16.5 µm48\,502\times 0.34 = 16\,490\,\mathrm{nm} = 16.5\,\text{µ}\mathrm{m}. 2. 48 502/10=485048\,502/10 = 4850 voltas. 3. 48 502×650=3.15×107 Da48\,502\times 650 = 3.15 \times 10^{7}\,\mathrm{Da}. 4. 3.15×107×1.66×10−24=5.2×10−17 g3.15 \times 10^{7}\times 1.66\times 10^{-24} = 5.2 \times 10^{-17}\,\mathrm{g}. 5. Dois por par: 97 00497\,004 fosfatos, carga líquida de −97 004 e-97\,004\,e. 6. G+C=0.499×97 004=48 405G + C = 0.499\times97\,004 = 48\,405: G=C=24 203G = C = 24\,203; A=T=24 299A = T = 24\,299. 7. 3×24 203+2×24 299=121 2073\times24\,203 + 2\times24\,299 = 121\,207. 8. 81.5+16.6×(−1)+0.41×49.9−500/48502=81.5−16.6+20.5−0.01=85.4 ∘C81.5 + 16.6\times(-1) + 0.41\times 49.9 - 500/48502 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 0.01 = 85.4\,{}^{\circ}\mathrm{C}. 9. 81.5−33.2+20.5=68.8 ∘C81.5 - 33.2 + 20.5 = 68.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Os cátions blindam a repulsão entre os dois esqueletos carregados negativamente; com menos sal as fitas se repelem mais e se separam a uma temperatura menor. 10. 35 %35\,\%: 81.5−16.6+14.4−0.5=78.8 ∘C81.5 - 16.6 + 14.4 - 0.5 = 78.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}; 62 %62\,\%: 81.5−16.6+25.4−0.5=89.8 ∘C81.5 - 16.6 + 25.4 - 0.5 = 89.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. A molécula inteira funde em etapas: as regiões ricas em A–T se abrem primeiro, e as ricas em G–C por último, de modo que a curva é uma subida larga com ombros, e não um degrau único e brusco. 11. 0.50×50=25 µg/mL0.50\times 50 = 25\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}; depois da fusão A260=0.70A_{260} = 0.70. 12. 25×10−6/5.2×10−17=4.8×101125\times 10^{-6}/5.2\times 10^{-17} = 4.8 \times 10^{11} moléculas. 13. 81.5−16.6+0.41×50−500/12=81.5−16.6+20.5−41.7=43.7 ∘C81.5 - 16.6 + 0.41\times 50 - 500/12 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 41.7 = 43.7\,{}^{\circ}\mathrm{C} (a fórmula é grosseira para trechos tão curtos). A 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} as extremidades pareiam, mas se abririam e fechariam; na célula uma enzima (a ligase) sela covalentemente as duas falhas, e o círculo deixa de depender dos doze pares. 14. π×(1.0)2×16 490=5.2×104 nm3\pi\times(1.0)^2\times16\,490 = 5.2 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 15. 43π×27.53=8.7×104 nm3\frac{4}{3}\pi\times 27.5^3 = 8.7 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 16. 60 %60\,\%: dois terços do empacotamento mais compacto possível de cilindros — o DNA é enrolado em espirais quase cristalinas. 17. Contraíons (poliaminas, Mg2+\mathrm{Mg^{2+}}) precisam neutralizar quase toda a carga, ou a repulsão não poderia ser vencida; a repulsão restante e a energia de dobramento armazenada nas espirais apertadas empurram para fora contra a casca, e quando a cauda se abre essa pressão impele a primeira parte do genoma para dentro da bactéria. 18. As alças num capsídeo de 55 nm55\,\mathrm{nm} têm raios de 10 to 25 nm10\text{ to }25\,\mathrm{nm}, abaixo dos 50 nm50\,\mathrm{nm} em que o DNA se dobra livremente: dobrá-lo custa energia, paga pelo motor de empacotamento (ATP) e armazenada como a pressão da questão 17. 19. 5′5'-AGGTCGCCGCCC-3′3'. 20. 12001200 nucleotídeos; 1200×330=4.0×105 Da1200\times 330 = 4.0 \times 10^{5}\,\mathrm{Da}. 21. 75×600=45 00075\times 600 = 45\,000 pares, 93 %93\,\% codificantes — um genoma compacto; o genoma humano é sessenta vezes menos denso em genes. 22. Duas forquilhas, cada uma copiando 24 25124\,251 pares em 1200 s1200\,\mathrm{s}: 20 20\, pares por segundo por forquilha (a polimerase do hospedeiro é capaz de 1000 1000\,; o tempo é fixado pelo ciclo inteiro, e não pela polimerase). 23. 121 207/48 502=2.5121\,207/48\,502 = 2.5 ligações por par; duas forquilhas a 20 pares por segundo: 100 ligações de hidrogênio por segundo — e outras tantas refeitas atrás delas. 24. Um par em 48 50248\,502 muda o G+CG + C em 0.002 %0.002\,\% e o TmT_m em 0.001 ∘C0.001\,{}^{\circ}\mathrm{C}: indetectável fundindo a molécula inteira; só uma sonda curta que cobrisse o sítio o mostraria. 25. Tm=85 ∘CT_m = 85\,{}^{\circ}\mathrm{C} em sódio a 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}; comprimento de contorno de 16.5 µm16.5\,\text{µ}\mathrm{m}, trezentas vezes o diâmetro do capsídeo, empacotado nele a 60 %60\,\% do volume dele.

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