Biologia universitária — 1.º ano · Bachelor Year 1

20Controle da expressão gênica

Uma bactéria que cresce em glicose carrega cinco moléculas da enzima que digere a lactose; dê lactose a ela e, em poucos minutos, ela carrega cinco mil. Uma célula do fígado e um neurônio carregam os mesmos vinte mil genes e fabricam conjuntos de proteínas quase inteiramente diferentes, e nenhum dos dois jamais fabricará o do outro. Nada no Capítulo 19 explica isso: a maquinaria da expressão é a mesma para todo gene. O que difere é se um gene é lido, com que frequência e por quanto tempo — decisões tomadas no promotor por proteínas que se ligam ao DNA, e depois dele pelo destino do mensageiro e da proteína. Este capítulo descreve como as bactérias ligam e desligam genes em resposta ao alimento delas, como os eucariotos controlam os genes deles pela cromatina, por intensificadores distantes e por combinações de fatores, e como o mesmo controle, aplicado a genes diferentes em células diferentes, faz um corpo a partir de um só genoma.

20.1 Por que e onde os genes são controlados

Proposição 20.1 (A expressão é regulada em todos os níveis)

Alguns genes são constitutivos — expressos sempre, num nível constante, porque os produtos deles são sempre necessários (as proteínas do ribossomo, as enzimas da glicólise). Quase todos são regulados: expressos apenas em algumas condições, em algumas células, em alguns momentos. O controle age em cada etapa do fluxo — sobretudo no início da transcrição, o lugar mais barato para decidir, mas também no processamento, na exportação, na estabilidade e na tradução do mensageiro, e na modificação e na degradação da proteína — e os tempos de resposta vão de segundos (uma proteína modificada) a minutos (um gene bacteriano ligado) e a dias (um estado de cromatina alterado).

Exemplo 20.2 (Fabricar enzimas só quando são necessárias)

A enzima $\beta$ -galactosidase, que parte a lactose, é um tetrâmero de quatro cadeias de $1024\,$ resíduos: cinco mil cópias são $3\,\%$ da proteína de uma célula e custam $8 \times 10^{7}\,$ ATP por geração. Uma bactéria que as fabricasse sem lactose para digerir cresceria cerca de um por cento mais devagar que uma competidora que não as fabricasse e, em algumas centenas de gerações, seria superada em número. A regulação é selecionada porque a expressão é cara.

20.2 O óperon lac

Definição 20.3 (Óperon, repressor, operador)

Um óperon é um grupo de genes bacterianos transcritos juntos a partir de um mesmo promotor num único mensageiro, e por isso controlados juntos. O óperon lac da E. coli reúne três genes para o uso da lactose — o lacZ ( $\beta$ -galactosidase), o lacY (a permease de lactose que a importa) e o lacA — atrás de um promotor e de um operador, uma sequência curta que se sobrepõe ao promotor. Um gene à parte, o lacI, fabrica o repressor lac, uma proteína que se liga ao operador e bloqueia a polimerase. A lactose, convertida na célula em alolactose, é o indutor: ela se liga ao repressor, muda a forma dele e o faz soltar o operador. O óperon fica, assim, desligado a menos que haja lactose — é um controle negativo suspenso pela indução.

O óperon lac. Sem lactose o repressor fica sobre o operador e a polimerase não consegue começar; com lactose o indutor puxa o repressor para fora e os três genes são transcritos num único mensageiro.

Proposição 20.4 (O modelo do óperon)

Os genes lac são controlados por um repressor difusível que age sobre um sítio adjacente aos genes: o controle é negativo, o repressor age em trans (de qualquer lugar da célula) e o operador age em cis (só sobre os genes ao lado dele).

Evidências. Jacob e Monod (1959–1961) raciocinaram a partir de mutantes. As linhagens mutantes no lacI ( $I^-$ ) fabricavam a enzima com ou sem lactose (de modo constitutivo); um gene lacI normal introduzido numa segunda cópia da região restabelecia a regulação, de modo que o produto do gene é um repressor difusível que falta ao mutante. As linhagens mutantes no operador ( $O^c$ ) também eram constitutivas, mas um segundo operador normal em outra cópia não restabelecia a regulação — o operador só controla os genes fisicamente ligados a ele, e portanto é um sítio, e não um produto. Uma terceira classe ( $I^s$ ) não podia ser induzida de modo nenhum, e era dominante: um repressor que já não liga o indutor. No experimento PaJaMo (1959) um gene lacI normal transferido por conjugação para uma célula $I^-$ desligou a síntese da enzima em poucos minutos: o repressor age rápido, e sobre a transcrição — mostrou-se depois que o mensageiro tem meia-vida de minutos. ∎

Definição 20.5 (Controle positivo: CAP e AMP cíclico)

O promotor lac é fraco: mesmo sem o repressor, a polimerase raramente começa, a não ser que uma segunda proteína, a CAP (proteína ativadora por catabólito), esteja ligada logo a montante dele, dobrando o DNA e segurando a polimerase no lugar. A CAP só se liga ao DNA quando carrega AMP cíclico, cujo nível na célula cai quando a glicose é abundante. O óperon, portanto, só fica plenamente ligado quando há lactose e não há glicose: dois sinais, um negativo e um positivo, são integrados num único promotor. Diante dos dois açúcares, a E. coli come primeiro a glicose, faz uma pausa enquanto o AMP cíclico sobe e as enzimas lac são fabricadas, e depois come a lactose — é a curva de crescimento em duas fases chamada diauxia, que Monod descreveu em 1941 e que o pôs no caminho do óperon.

Crescimento diáuxico da E. coli em glicose mais lactose. A cultura cresce só com a glicose, para quando ela acaba, e recomeça com a lactose depois da meia hora que leva para induzir o óperon lac. — Crescimento diáuxico da *E. coli* em glicose mais lactose. A cultura cresce só com a glicose, para quando ela acaba, e recomeça com a lactose depois da meia hora que leva para induzir o óperon lac.

O óperon lac tornado visível: colônias numa placa com X-gal, um substrato incolor que a -galactosidase torna azul. As colônias azuis expressam o lacZ; as brancas carregam um gene defeituoso — o repórter usado em mil experimentos. — O óperon lac tornado visível: colônias numa placa com X-gal, um substrato incolor que a $\beta$ -galactosidase torna azul. As colônias azuis expressam o *lacZ*; as brancas carregam um gene defeituoso — o repórter usado em mil experimentos.

Método 20.6 (Prever um fenótipo lac)

Escreva o genótipo de cada cópia da região: $I$ , $P$ , $O$ , $Z$ ( $^+$ normal, $^-$ inativo, $O^c$ operador constitutivo, $I^s$ superrepressor).
O repressor age em trans: um único $I^+$ em qualquer lugar reprime todo operador normal; o $I^s$ reprime haja o indutor que houver.
O operador e o promotor agem em cis: um $O^c$ libera apenas o $Z$ do próprio DNA dele; um $P^-$ silencia apenas os genes dele.
Pergunte, com e sem indutor, se cada gene $Z^+$ é transcrito; o fenótipo é induzível, constitutivo ou não induzível conforme o caso. Depois acrescente glicose: sem AMP cíclico e CAP, a transcrição é baixa faça o repressor o que fizer.

Exemplo 20.7 (Dois diploides parciais)

$I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : a cópia $I^+$ fabrica repressor, que se liga ao $O^+$ vizinho do $Z^+$ ; induzível — a mutação é complementada. $I^+\,O^c\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : o único $Z$ funcional fica atrás de um operador ao qual o repressor não consegue se ligar; constitutivo — o operador normal da outra cópia não ajuda, pois ele controla apenas o $Z$ defeituoso.

20.3 Outras estratégias bacterianas

Proposição 20.8 (Repressão, atenuação e fatores sigma)

Os óperons de biossíntese são controlados no sentido oposto: o óperon trp, cinco genes para fabricar triptofano, é transcrito a menos que haja triptofano — o aminoácido se liga ao repressor trp e o habilita a se ligar ao operador (é um correpressor). Um segundo controle, mais fino, a atenuação, usa o acoplamento entre transcrição e tradução nas bactérias: o começo do mensageiro codifica um peptídeo curto com dois triptofanos seguidos; se o tRNA carregado com triptofano for abundante, um ribossomo o traduz depressa e o RNA de trás se dobra num grampo terminador que para a polimerase antes dos genes; se o triptofano for escasso, o ribossomo empaca nos códons de triptofano e o RNA se dobra de outro modo, deixando a transcrição continuar. As bactérias também acionam conjuntos inteiros de genes trocando a subunidade $\sigma$ da polimerase delas: um $\sigma$ de choque térmico a dirige aos promotores dos genes de chaperonas; um $\sigma$ de esporulação, aos da formação de esporos.

20.4 O controle nos eucariotos

Definição 20.9 (Fatores de transcrição, intensificadores)

Nos eucariotos a polimerase nunca começa sozinha: os fatores gerais do promotor (Capítulo 19) a recrutam, e a velocidade é fixada por fatores de transcrição ligados a sequências reguladoras — algumas perto do promotor, muitas em intensificadores que podem estar a milhares de pares de bases de distância, a montante, a jusante ou num íntron, em qualquer orientação, e que agem dobrando o DNA de modo que os fatores ligados a eles toquem o complexo do promotor por meio de proteínas mediadoras. Um fator de transcrição é modular: um domínio de ligação ao DNA que reconhece uma sequência curta (das famílias hélice-volta-hélice, dedo de zinco, zíper de leucina) e um domínio de ativação ou de repressão que recruta ou bloqueia a maquinaria. Um gene é lido quando a combinação certa de fatores está presente: algumas centenas de fatores, em combinações, controlam vinte mil genes.

A ação de um intensificador. Ativadores ligados a um intensificador distante são levados até o promotor pelo dobramento do DNA, e um complexo mediador retransmite o sinal deles à polimerase.

Proposição 20.10 (A cromatina faz parte do controle)

Um gene envolvido em nucleossomos empacotados em heterocromatina não pode ser lido: os fatores não o alcançam. Os ativadores recrutam enzimas que acetilam as histonas, afrouxando a pegada delas sobre o DNA e marcando a região como aberta; os repressores recrutam enzimas que retiram os grupos acetila e acrescentam marcas que compactam a cromatina. Grupos metila acrescentados a citosinas de um promotor o silenciam de modo duradouro, e as marcas são copiadas na replicação, de modo que o padrão de genes abertos e fechados de uma célula é herdado pelas filhas dela — a memória pela qual as filhas de uma célula do fígado continuam células do fígado (o volume do Ano 3 trata a fundo desses mecanismos epigenéticos).

Evidências. Nos cromossomos politênicos gigantes das larvas de mosca (mil cópias de cada cromossomo lado a lado, com bandas), os genes em transcrição aparecem como pufes, em que a cromatina se desdobrou; o hormônio ecdisona, que desencadeia a muda, faz aparecer um conjunto específico de pufes em poucos minutos e outros horas depois, numa sequência fixa — a transcrição vista diretamente, e acionada por um sinal. Genes deslocados por rearranjo cromossômico para junto de heterocromatina são silenciados em algumas células e não em outras, e o estado é herdado pelas filhas delas. ∎

Um cromossomo politênico da glândula salivar de uma mosca: com bandas e com dois pufes em que a cromatina se abriu para a transcrição. Os pufes aparecem e desaparecem à medida que os genes são ligados e desligados.

Exemplo 20.11 (Um sinal vira um padrão de expressão)

O cortisol entra numa célula do fígado e se liga ao receptor dele, um fator de transcrição mantido inativo no citosol; o complexo entra no núcleo, liga-se a uma sequência de quinze bases presente perto de uma centena de genes — entre eles os da gliconeogênese (Capítulo 16) — e recruta acetilases e o mediador: em uma hora as enzimas da síntese de glicose já estão sendo fabricadas. O mesmo hormônio num linfócito, cuja cromatina aberta expõe um conjunto diferente dessas sequências, liga genes que matam a célula. Um sinal, um receptor, duas respostas: a diferença está em que genes estavam acessíveis.

20.5 Depois da transcrição, e a construção de um corpo

Proposição 20.12 (O controle além do promotor)

Uma célula eucariótica também decide como um transcrito sofre splicing (o splicing alternativo dá a um músculo e a um encéfalo proteínas diferentes a partir de um mesmo gene), se ele é exportado, quanto tempo ele dura (meias-vidas de minutos, para as mensagens de proteínas reguladoras, a dias, para a da hemoglobina, fixadas por sequências das regiões não traduzidas que ligam proteínas e pequenos RNAs reguladores) e se ele é traduzido (as células com falta de ferro bloqueiam a tradução da mensagem da ferritina por uma proteína ligada à extremidade $5'$ dela, e a liberam quando há ferro). A proteína, uma vez feita, é controlada por modificação e por degradação (Capítulo 13). Cada nível posterior é mais rápido e mais local que o anterior, e mais caro: a transcrição decide o que a célula pode fazer, e os níveis posteriores, o que ela faz agora.

Proposição 20.13 (A expressão diferencial faz um corpo)

Toda célula de um organismo pluricelular carrega o mesmo genoma; as células diferem porque expressam subconjuntos diferentes dele. Os genes de manutenção — alguns milhares, para o metabolismo, o ribossomo, o citoesqueleto — estão ligados em toda célula; os demais são ligados em algumas células e desligados em outras pelas combinações de fatores de transcrição que cada célula carrega e pelos estados de cromatina que ela herdou. O precursor de uma hemácia liga a globina e desliga quase todo o resto; um neurônio liga os canais dele e nunca mais se divide. A diferenciação é a aquisição de um padrão estável de expressão, e o desenvolvimento (o volume do Ano 2) é o processo pelo qual sinais entre células fixam esses padrões nos lugares certos.

Evidências. Um núcleo retirado de uma célula diferenciada de rã e colocado num óvulo cujo próprio núcleo foi removido consegue dirigir o desenvolvimento de um girino inteiro (Gurdon, 1962; retomado do volume do Ensino Médio): a célula diferenciada não tinha perdido nenhum gene, apenas os desligara, e o citoplasma do óvulo reajustou os interruptores. As proteínas de um tipo celular, separadas num gel, diferem das de outro tipo; os mensageiros dele, uma vez sequenciados, são um subconjunto do genoma específico dele; e um punhado de fatores de transcrição introduzidos numa célula da pele consegue reprogramá-la em célula-tronco ou em neurônio. ∎

Exemplo 20.14 (Um gene lido em dois órgãos)

O gene da enzima que fabrica glicose a partir de glicose-6-fosfato é expresso no fígado e no rim, e em nenhum outro tecido: o promotor dele carrega sítios para fatores presentes apenas ali, e nas demais células esse promotor está metilado e a cromatina dele, fechada. Um músculo, que carrega o gene intacto, não consegue liberar glicose no sangue (Capítulo 16) — não por falta do gene, e sim porque o gene não é lido. O genoma é o mesmo; a expressão é o órgão.

20.6 Exercícios

Exercício 20.1 ★

Cite os elementos do óperon lac e dê o estado do óperon com e sem lactose, com e sem glicose.

Solução

Solução de Exercício 20.1.

O lacI (gene do repressor), o promotor, o operador, o lacZ, o lacY, o lacA e o sítio da CAP. Sem lactose: desligado (repressor ligado). Com lactose e com glicose: mal ligado (repressor solto, mas sem AMP cíclico e CAP). Com lactose e sem glicose: plenamente ligado. Sem nenhum dos dois açúcares: desligado.

Exercício 20.2 ★

Explique a diferença entre um produto gênico que age em trans e um sítio que age em cis, com um exemplo de cada um no óperon.

Solução

Solução de Exercício 20.2.

Um produto que age em trans é uma molécula difusível que pode agir sobre qualquer cópia do alvo dela na célula: o repressor. Um sítio que age em cis é uma sequência de DNA que afeta apenas os genes fisicamente ligados a ela: o operador.

Exercício 20.3 ★

A partir da figura da diauxia, leia a duração da latência e os tempos de duplicação em cada açúcar.

Solução

Solução de Exercício 20.3.

Latência de cerca de $36\,\mathrm{min}$ (de $2\,\mathrm{h}$ a $2.6\,\mathrm{h}$ ); duplicação de $20\,\mathrm{min}$ em glicose e de $30\,\mathrm{min}$ em lactose.

Exercício 20.4 ★

Defina intensificador, fator de transcrição e gene de manutenção.

Solução

Solução de Exercício 20.4.

Intensificador: uma sequência reguladora, muitas vezes distante, que eleva a transcrição de um gene quando fatores se ligam a ela. Fator de transcrição: uma proteína com um domínio de ligação ao DNA e um domínio de ativação ou de repressão que regula a transcrição. Gene de manutenção: um gene expresso em toda célula num nível constante.

Exercício 20.5 ★★

Dê o fenótipo (induzível, constitutivo, não induzível) de: $I^-$ ; $O^c$ ; $I^s$ ; $I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^s\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ .

Solução

Solução de Exercício 20.5.

$I^-$ : constitutivo. $O^c$ : constitutivo. $I^s$ : não induzível. $I^-/I^+$ : induzível (o repressor $I^+$ age em trans). $I^s/I^+$ : não induzível ( $I^s$ é dominante). $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ : induzível — o único $Z$ funcional fica atrás de um operador normal.

Exercício 20.6 ★★

Compare os óperons lac e trp: o que a pequena molécula faz ao repressor em cada um, e por que a lógica é oposta.

Solução

Solução de Exercício 20.6.

Lac: o açúcar (indutor) se liga ao repressor e o solta do operador — as enzimas são fabricadas quando o substrato delas está presente. Trp: o aminoácido (correpressor) se liga ao repressor e o habilita a se ligar — as enzimas são fabricadas quando o produto delas está ausente. As vias catabólicas são ligadas pela entrada delas, e as anabólicas, desligadas pela saída delas.

Exercício 20.7 ★★

Um mutante não consegue fabricar AMP cíclico. Preveja o crescimento dele em glicose, só em lactose e nos dois açúcares, e o nível de $\beta$ -galactosidase em cada caso.

Solução

Solução de Exercício 20.7.

Em glicose: crescimento normal (a glicose não precisa de CAP). Só em lactose: quase nenhum crescimento — sem AMP cíclico, a CAP não consegue ativar o promotor lac, de modo que a enzima fica em poucos por cento do nível induzido, mesmo com o repressor solto. Nos dois: crescimento em glicose e depois uma parada; não há segunda fase. A enzima fica baixa em todos os casos.

Exercício 20.8 ★★

Explique por que a atenuação é impossível nos eucariotos, a partir da arquitetura da célula eucariótica.

Solução

Solução de Exercício 20.8.

A atenuação precisa que o ribossomo esteja traduzindo o mensageiro enquanto a polimerase ainda o transcreve, de modo que a posição do ribossomo molde o RNA atrás da polimerase. Nos eucariotos a transcrição está no núcleo e a tradução no citosol, e a mensagem só é traduzida depois de processada e exportada.

Exercício 20.9 ★★

Um intensificador é deslocado de $5\,\mathrm{kb}$ a montante do gene dele para $5\,\mathrm{kb}$ a jusante e é invertido; o gene continua sendo expresso. Explique o que isso mostra sobre como os intensificadores funcionam.

Solução

Solução de Exercício 20.9.

Os intensificadores agem a distância, em qualquer orientação e de qualquer lado, de modo que não podem funcionar por serem lidos nem por posicionarem diretamente a polimerase; eles funcionam ligando fatores que tocam o promotor por meio de uma alça de DNA, para a qual a distância e a orientação pouco importam.

Exercício 20.10 ★★★

Cinco mil tetrâmeros de $\beta$ -galactosidase de $4096\,$ resíduos custam quantos ATP (quatro por resíduo)? O orçamento de uma célula por geração é de cerca de $1 \times 10^{10}\,$ ATP. Calcule a desvantagem de crescimento de um mutante constitutivo, e o número de gerações para que a parcela dele numa população mista caia de metade para um centésimo.

Solução

Solução de Exercício 20.10.

$5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP: $0.8\,\%$ do orçamento. Velocidade de crescimento $0.8\,\%$ menor: por geração a parcela do mutante cai pelo fator $2^{-0.008} = 0.9945$ . De $1:1$ a $1:99$ : $0.9945^n = 1/99$ , $n = \ln 99/0.00555 = 830$ gerações — algumas semanas de cultura contínua.

Exercício 20.11 ★★★

Uma célula do fígado e um neurônio da mesma pessoa são comparados: mesmo genoma, proteínas diferentes, e cada divisão da célula do fígado dá células do fígado. Explique, com a cromatina, os fatores e a herança das marcas, como a diferença é feita e como ela é mantida.

Solução

Solução de Exercício 20.11.

Cada tipo celular carrega um conjunto específico de fatores de transcrição, que se ligam aos intensificadores dos genes dele e recrutam acetilases que abrem a cromatina deles, enquanto os genes dos outros tipos ficam metilados e empacotados em heterocromatina que fator nenhum alcança. Os fatores mantêm a expressão uns dos outros (uma rede com estados estáveis), e as marcas de cromatina são copiadas na replicação, de modo que as filhas herdam tanto os fatores quanto as regiões abertas e fechadas. O genoma é o mesmo; o genoma acessível não é, e a inacessibilidade é herdada.

Exercício 20.12 ★★★

“Uma bactéria lê o ambiente dela; uma célula de um corpo lê a história dela.” Discuta em um parágrafo os dois tipos de controle, os sinais deles, as escalas de tempo deles e a reversibilidade deles.

Solução

Solução de Exercício 20.12.

Os controles de uma bactéria são sintonizados no meio: um açúcar, um aminoácido, uma temperatura liga um repressor ou um fator sigma, e a resposta se completa em minutos e se desfaz assim que o sinal desaparece — a expressão acompanha o ambiente. A célula de um corpo também responde a sinais, mas as decisões principais dela foram tomadas durante o desenvolvimento e travadas na cromatina: o que ela pode expressar foi fixado pelos fatores que ela herdou e pelas marcas no DNA dela, alteradas só pela divisão e quase sempre irreversíveis. A bactéria é uma leitora do presente; a célula diferenciada tem uma memória que é a identidade dela.

20.7 Problema: A diauxia

Problema 20.1

Problema de fim de semana — a curva de crescimento em duas fases de Monod reconstruída célula a célula: glicose esgotada, lactose induzida, enzimas contadas, mutantes previstos e o custo da regulação calculado, terminando no fator de indução da $\beta$ -galactosidase

Uma cultura de E. coli começa com $10^7$ células por mililitro num meio com $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de glicose e $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de lactose. Em glicose as células dobram a cada $20\,\mathrm{min}$ , e em lactose a cada $30\,\mathrm{min}$ ; uma célula precisa de $1.5 \times 10^{-12}\,\mathrm{g}$ de açúcar por divisão ( $180\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ para a glicose; a lactose, de $342\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ , conta como duas glicoses). As células não induzidas contêm 5 moléculas de $\beta$ -galactosidase; plenamente induzidas, $5000$ . A indução leva $30\,\mathrm{min}$ . A enzima é um tetrâmero de $4\times 1024$ resíduos; cada resíduo custa 4 ATP; o orçamento de ATP de uma célula é de $10^{10}$ por divisão e a proteína dela é de $1.5 \times 10^{-13}\,\mathrm{g}$ ( $110\,\mathrm{Da}$ por resíduo).

Parte I — A fase da glicose.

Calcule a glicose disponível por mililitro, em gramas.
Quantas divisões por mililitro ela consegue sustentar?
Partindo de $10^7$ células, quantas células há quando a glicose acaba? (Uma divisão produz uma célula nova.)
Quantas duplicações são essas, e quanto dura a fase da glicose?
Durante essa fase, qual é o estado do óperon lac e por quê, em termos moleculares (repressor e CAP)?

Parte II — A virada.

Quando a glicose acaba, o que sobe dentro das células e a que isso se liga?
A lactose esteve presente o tempo todo. Por que, ainda assim, o óperon estava quase desligado durante a fase da glicose?
Durante os $30\,\mathrm{min}$ de latência cada célula fabrica as $5000$ enzimas dela. Calcule as moléculas de enzima fabricadas por segundo por célula, e os resíduos por segundo.
Uma célula contém $20\,000$ ribossomos a $20\,$ resíduos por segundo. Que fração da tradução dela é dedicada à $\beta$ -galactosidase durante a latência?
Calcule a massa de $5000$ tetrâmeros e a fração da proteína da célula que eles representam.
Calcule o fator de indução.
Por que a permease (lacY) é tão necessária quanto a enzima para o crescimento em lactose, e o que acontece com um mutante lacY $^-$ que recebe lactose?

Parte III — A fase da lactose.

Calcule a lactose disponível por mililitro em equivalentes de glicose, em gramas.
Quantas divisões a mais ela sustenta, e qual é a contagem final de células?
Quanto dura a fase da lactose?
Monte a linha do tempo: fase da glicose, latência, fase da lactose, total.
Explique por que o tempo de duplicação é maior em lactose (duas razões: uma sobre a etapa enzimática, outra sobre a permease).

Parte IV — Mutantes e custos.

Um mutante $I^-$ : descreva a curva de crescimento dele no mesmo meio e o nível de enzima dele ao longo de todo o processo.
Um mutante CAP $^-$ : descreva a curva e o nível de enzima dele.
Um mutante $O^c$ num meio só com lactose: há alguma diferença em relação ao tipo selvagem? E num meio só com glicose?
Calcule o custo em ATP, por geração, de fabricar $5000$ tetrâmeros, e a fração do orçamento da célula.
Se essa fração alongar o tempo de geração na mesma proporção, quanto a velocidade de crescimento do mutante $I^-$ fica atrás da do tipo selvagem em glicose?
Partindo de números iguais, depois de quantas gerações em glicose o mutante é um décimo da população? ( $r^n = 0.1/0.9$ com $r$ a razão entre as velocidades de crescimento por geração, ou seja, $2^{-\delta}$ para um atraso $\delta$ em duplicações.)
Explique por que, ainda assim, os mutantes $I^-$ são comuns nas linhagens de laboratório cultivadas em lactose.
Enuncie o resultado: o fator de indução da $\beta$ -galactosidase, o custo de fabricá-la sem necessidade como fração do orçamento de ATP, e o tempo total do experimento diáuxico. diauxic experiment.

Solução

Solução de Problema 20.1.

1. $0.5\times 10^{-3}\times 180 = 0.09\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 9 \times 10^{-5}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 2. $9\times 10^{-5}/1.5\times 10^{-12} = 6 \times 10^{7}$ divisões. 3. $10^7 + 6 \times 10^{7} = 7 \times 10^{7}$ células por mL. 4. $7 = 2^n$ : $n = 2.8$ duplicações, $56\,\mathrm{min}$ . 5. Desligado: a lactose (a alolactose) soltou o repressor, mas a glicose mantém o AMP cíclico baixo, de modo que a CAP não está ligada e o promotor fica quase silencioso; além disso a permease é escassa, e por isso entra pouca lactose. 6. O AMP cíclico sobe e se liga à CAP, que se liga ao promotor. 7. O controle negativo foi suspenso, mas faltava o controle positivo: um promotor fraco sem CAP raramente inicia (é a repressão catabólica). 8. $5000/1800 = 2.8$ tetrâmeros por segundo; $2.8\times 4096 = 11\,400$ resíduos por segundo. 9. Capacidade $20\,000\times 20 = 4 \times 10^{5}$ resíduos por segundo: $3\,\%$ dos ribossomos. 10. $5000\times 4096\times 110\times 1.66\times 10^{-24} = 3.7 \times 10^{-15}\,\mathrm{g}$ : $2.5\,\%$ da proteína da célula. 11. $5000/5 = 1000$ . 12. A lactose não atravessa a membrana sem a permease; um mutante lacY $^-$ tem a enzima mas não tem substrato dentro, e não cresce em lactose (nem se induz bem, já que o indutor é feito a partir da lactose dentro da célula). 13. $1.0\times 10^{-3}\times 342 = 0.342\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , que valem $2\times 180 = 360\,\mathrm{g}$ de glicose por mol, ou seja, $0.36\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ $= 3.6 \times 10^{-4}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 14. $3.6\times 10^{-4}/1.5\times 10^{-12} = 2.4 \times 10^{8}$ divisões; total final $7 \times 10^{7} + 2.4 \times 10^{8} = 3.1 \times 10^{8}$ por mL. 15. $3.1/0.7 = 4.4 = 2^n$ : $n = 2.1$ duplicações, $64\,\mathrm{min}$ . 16. Glicose $56\,\mathrm{min}$ , latência $30\,\mathrm{min}$ , lactose $64\,\mathrm{min}$ : $150\,\mathrm{min}$ ao todo. 17. A lactose precisa antes ser hidrolisada, uma etapa enzimática a mais cuja velocidade limita a oferta de glicose; e a permease usa o gradiente de prótons para importá-la, um custo que o transporte de glicose não paga. 18. $I^-$ : enzima em $5000$ o tempo todo (constitutiva, depois que a glicose acaba; em glicose a CAP ainda a limita, de modo que o nível é intermediário); a latência dele é mais curta ou inexistente, de modo que a curva mostra uma pausa menor; o custo o retarda um pouco em glicose. 19. CAP $^-$ : cresce em glicose até $7 \times 10^{7}$ e então para: o óperon lac não pode ser ativado, a enzima fica perto de 5 moléculas, e a lactose nunca é usada. 20. Só em lactose: nenhuma diferença no nível de enzima uma vez induzida (os dois plenamente ligados) e praticamente nenhuma no crescimento; ao $O^c$ apenas falta o atraso da indução. Só em glicose: o $O^c$ fabrica a enzima inutilmente (até onde a CAP permite), e o tipo selvagem não. 21. $5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP: $0.8\,\%$ de $10^{10}$ . 22. Tempo de geração $0.8\,\%$ maior: velocidade de crescimento $0.8\,\%$ menor, $\delta = 0.008$ duplicação por geração. 23. $r = 2^{-0.008} = 0.99447$ ; $r^n = 0.111$ : $n = \ln 0.111/\ln 0.99447 = 2.20/0.00555 = 400$ gerações. 24. Em lactose a enzima é necessária de qualquer modo, de modo que o mutante nada paga e ainda ganha a latência: ele não é selecionado contra, e às vezes é selecionado a favor; e as linhagens de laboratório são cultivadas por conveniência, e não em competição. 25. Fator de indução de 1000 (de 5 a $5000$ moléculas); a síntese desnecessária custa $0.8\,\%$ do orçamento de ATP; o experimento dura cerca de duas horas e meia.

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