31Cromatografia

Uma gota de bebida energética, diluída e filtrada, é injetada em um tubo de aço não mais longo que uma caneta e recheado de grãos de sílica de alguns micrômetros. Alguns minutos depois, um detector traçou uma linha com um punhado de picos, e a partir da área de um deles o laboratório informa quanta cafeína a lata contém, com precisão de alguns por cento. A cromatografia separa os componentes de uma mistura fazendo-os correr através de uma coluna a velocidades diferentes; este capítulo explica por que eles viajam a velocidades diferentes, por que seus picos têm a largura que têm, como separar dois vizinhos, e como transformar um pico em uma quantidade.

O que você já sabe

O volume escolar: cromatografia em papel e em camada delgada, cromatograma, eluente. O volume do 1.º ano: o coeficiente de partição, a extração líquido–líquido, o fator de retenção $R_f$ de uma placa de camada delgada. Capítulo 7: o prato teórico de uma coluna de destilação.

31.1 Princípio

Definição 31.1 (Cromatografia)

A cromatografia separa os componentes de uma mistura distribuindo-os entre uma fase estacionária, fixada em uma coluna ou em uma placa, e uma fase móvel, um gás ou um líquido que escoa ao longo dela. Arrastar os componentes através da coluna e para fora dela com a fase móvel é a eluição.

Uma molécula só avança enquanto está na fase móvel; enquanto está retida pela fase estacionária, ela espera. Ela passa de uma fase à outra milhões de vezes em seu trajeto, de modo que sua velocidade média é fixada pela fração do tempo que passa em cada uma, isto é, por seu equilíbrio de partição.

Definição 31.2 (Retenção)

O tempo de retenção $t_R$ de um composto é o tempo entre a injeção e o máximo de seu pico; o tempo morto $t_M$ é o tempo de retenção de um composto não retido, que nunca entra na fase estacionária. O fator de retenção $k$ de um composto em uma coluna é

$$k = \frac{t_R - t_M}{t_M}.$$

Ele não é o $R_f$ de uma placa de camada delgada, que mede uma distância percorrida, embora ambos descrevam a mesma partição.

Proposição 31.3 (Tempo de retenção)

Se, no equilíbrio, as quantidades de um composto nas fases estacionária e móvel de uma fatia de coluna são $n_s$ e $n_m$, o composto avança a $u/(1 + n_s/n_m)$, onde $u$ é a velocidade da fase móvel, e $t_R = t_M(1 + n_s/n_m)$.

Proposição 31.4 (Retenção e partição)

O fator de retenção é a razão das quantidades nas duas fases, $k = n_s/n_m = KV_s/V_m$, onde $K$ é o coeficiente de partição (concentração na fase estacionária sobre concentração na fase móvel) e $V_s$, $V_m$ os volumes das fases na coluna.

Dois compostos se separam se seus coeficientes de partição diferem; a geometria da coluna ($V_s/V_m$) multiplica todas as retenções igualmente. Mudar a fase móvel, o que muda $K$, é a principal alavanca do químico sobre a retenção.

31.2 Largura de pico e número de pratos

Uma banda não permanece fina. As moléculas de um mesmo composto seguem caminhos diferentes entre os grãos, difundem ao longo da coluna e se atrasam na fase estacionária em quantidades aleatórias. O pico registrado na saída é quase exatamente uma gaussiana de desvio-padrão $\sigma_t$ (em tempo), e quanto mais estreito ele é para um dado $t_R$, melhor a coluna.

Definição 31.5 (Número de pratos)

O número de pratos de uma coluna para um composto é $N = (t_R/\sigma_t)^2$, onde $\sigma_t$ é o desvio-padrão de seu pico em tempo. A altura de prato é $H = L/N$, para uma coluna de comprimento $L$.

Os nomes vêm da coluna de destilação do Capítulo 7: uma coluna cromatográfica se comporta como se fosse uma pilha de $N$ estágios de equilíbrio, cada um de altura $H$. A analogia é uma maneira de contar, não uma imagem da coluna.

Proposição 31.6 (Número de pratos a partir de um pico)

Com $w$ a largura na base entre as tangentes nos pontos de inflexão e $w_{1/2}$ a largura a meia altura,

$$N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2 = 5.54\left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2.$$

Proposição 31.7 (Equação de van Deemter)

A altura de prato depende da velocidade linear $u$ da fase móvel segundo

$$H = A + \frac{B}{u} + Cu,$$

onde $A$ representa os diferentes caminhos através do recheio, $B/u$ a difusão ao longo da coluna (pior quando as moléculas ficam mais tempo) e $Cu$ a troca lenta com a fase estacionária (pior quando a fase móvel passa depressa). $H$ é mínima em $u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{B/C}$, onde $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$.

A forma da equação é admitida; seu mínimo, não. $\mathrm dH/\mathrm du = -B/u^2 + C$ se anula em $u = \sqrt{B/C}$, e ali $B/u = Cu = \sqrt{BC}$, logo $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$; a derivada segunda $2B/u^3$ é positiva, portanto trata-se de um mínimo. Grãos pequenos reduzem $A$ e $C$: é por isso que a cromatografia líquida moderna usa partículas de alguns micrômetros e altas pressões para empurrar a fase móvel através delas.

31.3 Separar dois compostos

Definição 31.8 (Seletividade e resolução)

Para dois picos vizinhos com $k_2 > k_1$, o fator de seletividade é $\alpha = k_2/k_1$, e a resolução é

$$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_1 + w_2},$$

a distância entre os picos dividida por sua largura média na base.

Com $R_s = 1$ os picos ainda se sobrepõem visivelmente; com $R_s = 1.5$ o sinal volta à linha de base entre eles (separação até a linha de base), que é o objetivo habitual em trabalho quantitativo.

Teorema 31.9 (Equação da resolução)

Para dois picos vizinhos com o mesmo número de pratos $N$,

$$R_s = \frac{\sqrt N}{4}\,\frac{\alpha - 1}{\alpha}\,\frac{k_2}{1 + k_2}.$$

Método 31.10 (Melhorar uma resolução)

1. Eficiência: $R_s \propto \sqrt N$. Dobrar o comprimento da coluna dobra $N$ e o tempo de análise, mas multiplica $R_s$ por apenas $\sqrt2 \approx 1.41$; partículas menores ou a vazão ótima aumentam $N$ a comprimento constante.
2. Seletividade: o fator $(\alpha - 1)/\alpha$ é o mais sensível. Mude a fase móvel (solvente, pH), a fase estacionária ou, em cromatografia gasosa, a temperatura.
3. Retenção: $k_2/(1+k_2)$ sobe rapidamente até $k \approx 2$ e lentamente além disso, enquanto o tempo continua a crescer como $1 + k$; vise $k$ entre cerca de 2 e 10.

31.4 As técnicas

Definição 31.11 (Técnicas cromatográficas)

Na cromatografia gasosa (CG), a fase móvel é um gás (hélio, hidrogênio ou nitrogênio) e a fase estacionária um filme líquido que reveste o interior de uma longa coluna capilar, mantida em um forno. Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), uma bomba empurra uma fase móvel líquida através de uma coluna curta recheada de pequenas partículas. Na CLAE em fase reversa, a fase estacionária é apolar (sílica que leva longas cadeias alquila) e a fase móvel uma mistura polar de água com metanol ou acetonitrila. Na eluição por gradiente, a composição da fase móvel é modificada durante a corrida, em cromatografia líquida, para eluir mais depressa os compostos fortemente retidos.

A escolha entre elas decorre da volatilidade. A CG exige compostos que se vaporizem sem se decompor, aproximadamente abaixo de $400{}^{\circ}\mathrm{C}$: solventes, combustíveis, fragrâncias, pequenas moléculas orgânicas. Elevar a temperatura do forno durante a corrida (uma rampa de temperatura) elui mais cedo os compostos mais pesados, como faz um gradiente em CLAE. A CLAE trata tudo o que se dissolve, incluindo sais, açúcares, fármacos e proteínas. Em fase reversa, os compostos mais polares saem primeiro e os mais apolares por último; acrescentar mais solvente orgânico à fase móvel diminui todas as retenções. A cromatografia em coluna preparativa, e sua versão mais rápida, a cromatografia flash, aplicam o mesmo princípio em grande escala para purificar gramas de produto, em geral sobre sílica polar com misturas de hexano e acetato de etila.

31.5 Análise quantitativa

A área de um pico é proporcional à quantidade de composto que chegou ao detector, mas a constante de proporcionalidade depende do composto e do detector. Os volumes injetados, da ordem do microlitro, não são perfeitamente reprodutíveis. Um padrão interno elimina as duas dificuldades.

Definição 31.12 (Fator de resposta e padrão interno)

Um padrão interno é um composto, ausente da amostra, acrescentado em quantidade conhecida a toda solução analisada; ele deve ser resolvido de todos os outros picos e se comportar como o analito. O fator de resposta $F$ de um analito em relação ao padrão interno é definido por

$$\frac{A_X}{A_{IS}} = F\,\frac{c_X}{c_{IS}},$$

onde $A$ são áreas de pico e $c$ concentrações na solução injetada.

Proposição 31.13 (Quantificação por padrão interno)

$F$ medido em uma solução de calibração de $c_X$ e $c_{IS}$ conhecidos dá, para uma amostra dopada com o padrão interno a $c_{IS}$, $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, qualquer que seja o volume injetado.

Método 31.14 (Quantificar com um padrão interno)

1. Escolha um padrão de estrutura próxima à do analito, ausente da amostra, eluindo perto dele mas resolvido ($R_s \ge 1.5$).
2. Injete uma solução de calibração de $c_X$ e $c_{IS}$ conhecidos; calcule $F$ a partir da razão das áreas.
3. Acrescente o padrão à solução da amostra na mesma $c_{IS}$; injete; leia $A_X/A_{IS}$.
4. Calcule $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, e depois remonte todas as diluições até a amostra original.

Uma calibração externa (uma série de padrões do analito sozinho, depois a amostra, todos injetados da mesma maneira) é mais simples, mas supõe que o volume injetado e o detector permaneçam constantes entre as corridas.

História — A escrita das cores, 1906

O botânico Mikhail Tsvet derramou um extrato de folhas verdes em um tubo de vidro cheio de giz em pó e o lavou com um solvente: os pigmentos se separaram em bandas coloridas, clorofilas verdes e carotenoides amarelos. Em 1906 ele chamou o método de cromatografia, “escrita das cores”. Ele foi amplamente ignorado durante um quarto de século, até ser retomado para os produtos naturais nos anos 1930. (Retrato: autor desconhecido, domínio público; Wikimedia Commons.)

Segurança

A acetonitrila e o metanol, os componentes orgânicos habituais das fases móveis de CLAE, são inflamáveis e tóxicos; o hexano, usado em cromatografia em coluna, é inflamável, perigoso para a saúde e tóxico para a vida aquática. Os resíduos de solvente são recolhidos, nunca despejados na pia.

31.6 Exercícios

Exercício 31.1 ★

Um composto tem $t_R = 5.0\,\mathrm{min}$ em uma coluna cujo tempo morto é $1.0\,\mathrm{min}$. Calcule seu fator de retenção e a fração de seu tempo passada na fase móvel.

Solução

Solução de Exercício 31.1.

$k = (5.0 - 1.0)/1.0 = 4.0$; fração do tempo na fase móvel $1/(1 + k) = 0.20$.

Exercício 31.2 ★

Um pico em $t_R = 6.0\,\mathrm{min}$ tem uma largura na base de $0.30\,\mathrm{min}$. Calcule o número de pratos.

Solução

Solução de Exercício 31.2.

$N = 16(6.0/0.30)^2 = 16 \times 400 = 6400$.

Exercício 31.3 ★

Uma coluna de $250\,\mathrm{mm}$ dá $N = 10\,000$ para um composto. Calcule a altura de prato.

Solução

Solução de Exercício 31.3.

$H = 250\,\mathrm{mm}/10\,000 = 0.025\,\mathrm{mm} = 25\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Exercício 31.4 ★

CG ou CLAE? Etanol no sangue; uma proteína; cafeína em uma bebida; benzeno na gasolina; açúcares em um suco de fruta.

Solução

Solução de Exercício 31.4.

Etanol no sangue: CG (volátil). Proteína: CLAE. Cafeína em uma bebida: CLAE (em água, pouco volátil sem preparação). Benzeno na gasolina: CG. Açúcares: CLAE (eles se decompõem antes de ferver).

Exercício 31.5 ★★

Dois picos: $t_{R1} = 4.0\,\mathrm{min}$, $w_1 = 0.40\,\mathrm{min}$; $t_{R2} = 4.6\,\mathrm{min}$, $w_2 = 0.50\,\mathrm{min}$. Calcule a resolução. Eles estão separados até a linha de base?

Solução

Solução de Exercício 31.5.

$R_s = 2(4.6 - 4.0)/(0.40 + 0.50) = 1.2/0.90 \approx 1.3$: não totalmente separados até a linha de base (abaixo de 1.5).

Exercício 31.6 ★★

Quantos pratos são necessários para separar dois compostos com $\alpha = 1.10$ e $k_2 = 4.0$ com $R_s = 1.5$?

Solução

Solução de Exercício 31.6.

$\sqrt N = 4R_s\,\dfrac{\alpha}{\alpha - 1}\,\dfrac{1 + k_2}{k_2} = 4 \times 1.5 \times 11 \times 1.25 = 82.5$, logo $N \approx 6.8 \times 10^3$.

Exercício 31.7 ★★

Uma coluna tem $A = 5\,\text{µ}\mathrm{m}$, $B = 8\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$, $C = 2\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}/\mathrm{mm}$ (dados do exercício). Encontre a velocidade ótima e a menor altura de prato.

Solução

Solução de Exercício 31.7.

$u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{8/2} = 2\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$; $H_{\min} = 5 + 2\sqrt{16} = 13\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Exercício 31.8 ★★

Preveja a ordem de eluição do benzeno, do fenol e do tolueno em CLAE de fase reversa com uma fase móvel água–metanol, e o que acontece quando a fração de metanol é aumentada.

Solução

Solução de Exercício 31.8.

O fenol ($\ce{OH}$ polar, ligações de hidrogênio com a água) primeiro, depois o benzeno, depois o tolueno (um $\ce{CH3}$ a mais, mais apolar). Mais metanol torna a fase móvel menos polar: os três eluem mais cedo, na mesma ordem.

Exercício 31.9 ★★

Uma solução de calibração de um analito a $20.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ com o padrão interno a $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dá áreas 860 e 400. Uma amostra dopada com o padrão a $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dá áreas 645 e 410. Calcule o fator de resposta e a concentração do analito (dados do exercício).

Solução

Solução de Exercício 31.9.

$F = (860/400)/(20.0/10.0) = 2.15/2.00 = 1.075$. Amostra: $c_X = (645/410) \times 10.0/1.075 \approx 14.6\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$.

Exercício 31.10 ★★★

Uma separação dá $R_s = 1.06$. Que comprimento de coluna, em relação ao atual, dá $R_s = 1.5$, e quanto isso custa em tempo? Que outras alavancas existem?

Solução

Solução de Exercício 31.10.

$R_s \propto \sqrt N \propto \sqrt L$: $L$ deve ser multiplicado por $(1.5/1.06)^2 \approx 2.0$, o que dobra o tempo de análise e a pressão. Outras alavancas: a seletividade (fase móvel, fase estacionária, temperatura), partículas menores, a vazão ótima.

Exercício 31.11 ★★★

Para dois picos gaussianos de mesma altura e largura, com largura na base $w = 4\sigma$, calcule o sinal a meio caminho entre eles, em relação à altura do pico, com $R_s = 1$ e com $R_s = 1.5$ (despreze a contribuição do pico distante em cada máximo).

Solução

Solução de Exercício 31.11.

Os picos estão separados por $4\sigma R_s$, de modo que o ponto médio fica a $2\sigma R_s$ de cada um. $R_s = 1$: cada pico contribui com $\mathrm e^{-(2)^2/2} = \mathrm e^{-2} = 0.135$; o vale fica a $0.27$ da altura do pico. $R_s = 1.5$: $2\mathrm e^{-(3)^2/2} = 2\mathrm e^{-4.5} \approx 0.022$, cerca de 2 %: de volta à linha de base para fins práticos.

Exercício 31.12 ★★★

Com $N$ e $\alpha$ constantes, compare o fator de resolução $k_2/(1+k_2)$ e o tempo relativo de análise $1 + k_2$ para $k_2 = 2$, 5 e 10. Que faixa de $k$ você escolheria?

Solução

Solução de Exercício 31.12.

$k_2/(1+k_2)$: 0.67, 0.83, 0.91; tempo em unidades de $t_M$: 3, 6, 11. Passar de 2 a 5 ganha 25 % em resolução pelo dobro do tempo; de 5 a 10, 9 % por quase o dobro outra vez. Um $k$ de cerca de 2 a 5 é o compromisso habitual.

31.7 Problema: A cafeína de uma bebida energética

Problema 31.1

Problema de fim de semana — a ordem de eluição em fase reversa, o desempenho da coluna a partir de um cromatograma, melhorar a separação, e a quantificação com um padrão interno

Dados do exercício (inventados, não um método real). Uma bebida energética é diluída dez vezes ($5.00\,\mathrm{mL}$ em $50.0\,\mathrm{mL}$) e a teofilina é acrescentada como padrão interno a $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ na solução diluída. Coluna: $150\,\mathrm{mm}$, fase reversa; fase móvel água–metanol; detecção UV. A matriz não retida (açúcares e sais) elui em $t_M = 1.0\,\mathrm{min}$; a teofilina em $3.0\,\mathrm{min}$ (largura na base $0.18\,\mathrm{min}$); a cafeína em $3.4\,\mathrm{min}$ (largura na base $0.20\,\mathrm{min}$). Calibração: cafeína $50.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ e teofilina $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dão áreas 1500 e 1000. Amostra: áreas 970 (cafeína) e 1010 (teofilina). Uma lata contém $250\,\mathrm{mL}$.

Parte I — Fase reversa.

1. Descreva as fases estacionária e móvel de uma coluna de fase reversa.
2. Por que os açúcares eluem no tempo morto?
3. A cafeína é a 1,3,7-trimetilxantina, a teofilina a 1,3-dimetilxantina. Explique sua ordem de eluição.
4. Por que a teofilina é aqui um bom padrão interno?
5. O que aconteceria com os dois tempos de retenção se a fração de metanol fosse aumentada?
6. O que mede o tempo morto?

Parte II — Desempenho da coluna.

7. Calcule os fatores de retenção da teofilina e da cafeína.
8. Calcule o fator de seletividade.
9. Calcule o número de pratos para a cafeína e para a teofilina.
10. Calcule a altura de prato para a cafeína.
11. Calcule a resolução entre os dois picos.
12. Verifique-a com a equação da resolução.
13. Os picos estão separados até a linha de base?

Parte III — Mais rápido ou melhor.

14. Para ganhar tempo, a coluna é encurtada para $75\,\mathrm{mm}$ (mesmo recheio e mesma vazão). O que acontece com a resolução?
15. E com o tempo de análise?
16. O que daria em vez disso uma coluna de $300\,\mathrm{mm}$, e a que custo?
17. Que alavanca age sobre $\alpha$?
18. Aumentar $k$ ajudaria muito aqui?

Parte IV — Quantificação.

19. Calcule o fator de resposta da cafeína em relação à teofilina.
20. Por que o volume injetado não importa?
21. Calcule a concentração de cafeína na solução diluída.
22. Calcule a concentração de cafeína na bebida.
23. O que daria errado se um composto da matriz coeluísse com a teofilina?
24. O que uma calibração externa exigiria em vez disso?
25. Dê a massa de cafeína em uma lata de $250\,\mathrm{mL}$.

Solução

Solução de Problema 31.1.

1. Estacionária: grãos de sílica que levam longas cadeias alquila, apolar. Móvel: água com metanol, polar. 2. Eles são muito polares e ficam na fase móvel: $k \approx 0$. 3. A cafeína tem um grupo metila a mais que a teofilina, e a teofilina um $\ce{N-H}$ que forma ligações de hidrogênio com a água: a teofilina é mais polar e elui primeiro. 4. Ela tem estrutura próxima (resposta e comportamento semelhantes), está ausente da bebida, e elui perto da cafeína sendo resolvida dela. 5. Ambos diminuiriam: uma fase móvel menos polar compete melhor com a fase estacionária. 6. O tempo que a fase móvel leva para atravessar a coluna, o tempo que um composto passa em movimento. 7. $k_{\mathrm{teo}} = (3.0 - 1.0)/1.0 = 2.0$; $k_{\mathrm{caf}} = 2.4$. 8. $\alpha = 2.4/2.0 = 1.2$. 9. Cafeína $N = 16(3.4/0.20)^2 = 4624 \approx 4.6 \times 10^3$; teofilina $16(3.0/0.18)^2 \approx 4.4 \times 10^3$. 10. $H = 150\,\mathrm{mm}/4624 \approx 0.032\,\mathrm{mm} = 32\,\text{µ}\mathrm{m}$. 11. $R_s = 2(3.4 - 3.0)/(0.18 + 0.20) = 0.80/0.38 \approx 2.1$. 12. $\frac{\sqrt{4624}}{4} \times \frac{0.2}{1.2} \times \frac{2.4}{3.4} = 17 \times 0.167 \times 0.706 \approx 2.0$; a pequena diferença vem da hipótese de larguras iguais da equação. 13. Sim: $R_s > 1.5$. 14. $N$ é dividido por dois: $R_s \approx 2.1/\sqrt2 \approx 1.5$, justo na separação até a linha de base. 15. Dividido por dois: a cafeína em $1.7\,\mathrm{min}$. 16. $R_s \approx 2.1\sqrt2 \approx 3.0$, pelo dobro do tempo e o dobro da pressão: um desperdício aqui. 17. A composição da fase móvel (fração de metanol, pH, outro solvente orgânico) ou a fase estacionária. 18. Pouco: $k_2/(1 + k_2) = 0.71$ já; com $k_2 = 5$ seria 0.83 (+18 %) por um tempo de análise multiplicado por $6/3.4 \approx 1.8$. 19. $F = (1500/1000)/(50.0/40.0) = 1.50/1.25 = 1.20$. 20. Os dois picos vêm da mesma injeção: o volume se cancela na razão das áreas. 21. $c = (970/1010) \times 40.0/1.20 \approx 32.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 22. Diluição de dez vezes: $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 23. $A_{IS}$ seria grande demais, e o resultado para a cafeína baixo demais. 24. Uma série de padrões de cafeína injetados exatamente nas mesmas condições que a amostra, uma reta de calibração da área em função da concentração, e volumes de injeção reprodutíveis. 25. $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L} \times 0.250\,\mathrm{L}$: $\boldsymbol{\approx 80\,\mathrm{mg}}$ de cafeína por lata (dados do exercício).